酶标试剂盒-Rat VEGF ELISA Kit (High Sensitivity)

Datasheet

检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗Rat VEGF 抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体,经过孵育,样本中存在的Rat VEGF 与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。洗涤后,加入显色底物 TMB,避光显色。颜色反应的深浅与样本中Rat VEGF 的浓度成正比。加入终止液终止反应,在 450 nm 波长(参考波长 570 - 630 nm)测定吸光度值。

样本采集与贮存

1. 细胞培养上清

300 × g 离心 10 分钟去除沉淀物,即刻检测,或者分装,-20℃以下贮存。

2. 血清样本

离心管收集血清。血样凝集 30 分钟后,1,000 × g 离心 10 分钟。吸取血清样本之后即刻检测,或者分装,-20℃以下贮存。

3. 血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1,000 × g 离心 30 分钟收集样本。即刻检测,或者分装,-20℃以下贮存。本试剂盒可能适用于其它生物学样本。细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

试剂盒提供的材料

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自备材料

1) 能够检测 450 nm 吸光度的酶标仪,参考波长 570 nm 或 630 nm

2) 移液器及枪头、加样槽

3) 准备试剂用的试管、离心管、量筒等

4) 蒸馏水或去离子水

5) 涡旋振荡器、微孔板振荡器



试剂准备

检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温(18℃-28℃)。如果浓缩的试剂出现结晶,37℃温浴,直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×浓缩洗液 50 ml 至 1 L 的量筒,加蒸馏水至 1,000 ml,轻轻混匀,避免泡沫。转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存,1×洗液可稳定保存 30 天。

1×检测缓冲液

吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒,加蒸馏水至 50 ml,轻轻混匀,避免泡沫。2 - 8℃贮存,1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。

试剂盒保存于 2 - 8℃,有效期标注于标签上。

Application

技术要点

1) 重溶或者混合蛋白的时候,始终避免气泡产生。

2) 避免交叉污染,在进行标准品加样、样本加样,以及不同试剂加样的时候,请更换枪头。不同的试剂,使用不同的加样槽。

3) 在应用自动洗板机时,加入洗液之后,设置 30 秒的浸泡程序,或者在不同的洗涤步骤将微孔板掉转 180 度,这样可以提高分析的准确度。

4) 为保证结果的精确性,孵育时封好封板膜。

5) 显色底物在添加之前应是无色的。保持显色底物始终处于避光态。

6) 终止液的添加顺序应与显色底物的添加顺序相同。

添加终止液之后,底物的颜色应由蓝色转变为黄色。如果底物呈现绿色,说明终止液与显色底物没有充分混匀。

7) 推荐所有的检测样本和标准品在检测中设复孔。

8) 在任何情况下,避免接触微孔板的内表面。

操作步骤

检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。
1) 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。
2) 将不需要的板条拆卸下来,放回装有干燥剂的铝箔袋,重新封好封口。
3) 浸泡酶标板:加入 300μl 1×洗液静置浸泡 30 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后,在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后,请立即使用微孔板,不要让微孔板干燥。
4) 加标准品:标准品孔加入 100μl 2倍倍比稀释的标准品。空白孔加入 100μl 1×检测缓冲液(血清/血浆样本)或培养基
(细胞培养上清样本)。
5) 加样本:血清/血浆:样本孔加入 80μl 1×检测缓冲液和 20μl 样本。细胞培养上清:样本孔加入 100μl 细胞培养上
清。保证步骤 4、5 连续加样,不要间断。加样过程在 15 分钟内完成。
6) 孵育:使用封板膜封板。300 转/分钟振荡,室温孵育 1.5 小时。
7) 洗涤:弃掉液体,每孔加入 300μl 洗液洗板,洗涤 6 次。每次洗板,在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能,必
须彻底移除残留液体。
8) 加检测抗体:每孔加入 100μl 稀释的检测抗体(1:100 稀释)。使用封板膜封板。300 转/分钟振荡,室温孵育 30 分钟。
9) 洗涤:重复步骤 7。
10) 加酶孵育:每孔加入 100μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100 稀释)。使用新的封板膜封板。300 转/分
钟振荡,室温孵育 30 分钟。
11) 洗涤:重复步骤 7。
12) 加信号增强剂孵育:每孔加入 100μl 稀释的信号增强剂(1:100 稀释)。使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡,室温
精确孵育 15 分钟。
13) 洗涤:重复步骤 7。
14) 再次加酶孵育:每孔加入 100μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100 稀释)。使用新的封板膜封板。300
转/分钟振荡,室温精确孵育 15 分钟。
15) 洗涤:重复步骤 7。
16) 加底物显色:每孔加入 100μl 显色底物 TMB,避光,室温孵育 5 - 30 分钟。
17) 加终止液:每孔加入 100μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻
叩击板框,充分混匀。
18) 检测读数:在 30 分钟之内,使用酶标仪进行双波长检测,测定 450 nm 最大吸收波长和 570 nm 或 630 nm 参考波长
下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。仅使用 450 nm 测定会导致 OD
值偏高,并且准确度降低。

结果计算

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试剂盒性能

1) 准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.99;

2) 灵敏度:最低检测浓度小于50pg/mL;

3) 特异性:不与其他可溶性结构类似物交叉反应;

4) 重复性:板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%;

5) 贮藏:2-8°C,遊光防潮保存;

6) 有效期:6个月。

免责申明

1) 试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责;

2) 严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。

AB-LH383

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Note:  Application as IHC, only suitable for histochemical staining or fluorescence staining of paraffin-embedded sections. Application as ICC/IF, suitable for histochemical or fluorescent staining of frozen sections, as well as chemical and fluorescent staining at the cellular level.

注意:抗体应用为IHC的,抗体只适合于石蜡切片的组化染色或者荧光染色。

抗体应用为IF/ICC的,抗体适合于冰冻切片的组化染色或者荧光染色,以及细胞水平的化学染色和荧光染色。

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