1. 可识别Ser / Thr / Tyr 的所有磷酸化形式。

2. 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续操作。

3. 在制备SDS-PAGE凝胶时只需在丙烯酰胺溶液中简单加入A液和B液即可。

4. 可用总抗体而非抗磷酸化蛋白的抗体即可同时检测磷酸化和非磷酸化的蛋白。

做Western Blotting实验方便快捷：

? 不需要准备针对磷酸化蛋白的抗体。

? 可用于内源性蛋白的磷酸化分析。

? 不需要放射性同位素标记。

A液：400ul （20uM浓度：每块分离胶加入40ul；50uM浓度：每块分离胶加入100ul；）

B液：400ul （20uM浓度：每块分离胶加入40ul；50uM浓度：每块分离胶加入100ul；）

注：常规使用浓度为20uM，如过表达体系；如果目的蛋白浓度较低，则建议使用50uM或者100uM浓度。（最佳使用浓度取决于蛋白，请根据每个蛋白的具体情况摸索合适的条件）

1. 按照常规配制分离胶的配方进行配胶（配方参见附表）；

2. 在加入TEMED之前加入产品A液和B液（需要充分混匀）；

4度避光保存，12-18个月

1. 提高转膜效率

电泳后，电转之前，需要使用螯合剂（EDTA）从凝胶中除去锰离子（Mn2+）。此步骤可提高磷酸化和非磷酸化蛋白转移到PVDF膜上的转移效率。

1）电泳后，将凝胶在含有1?10mmol/L EDTA的转膜缓冲液中浸泡至少10分钟，同时轻轻摇动。（10分钟×1?3次）。

2）接下来，将凝胶在不含EDTA的转膜缓冲液中浸泡10分钟，同时轻轻摇动（10分钟×1次）。

3）强烈推荐使用湿法进行转膜，也可以使用半干法。

2. 条带弯曲

P-Tag电泳SDS-PAGE常见的问题是“条带弯曲”。需要确保样品中不含有EDTA。

1）预染的marker：由于泳道之间盐浓度的差异，marker和样品的条带均会受影响。使用预染marker常常导致条带弯曲，在含有该Marker的溶液和其他溶液之间至少需要留一条空白泳道。

2）酸性样品：条带可能弯曲。如果溶液为黄色至橙色，即使在加入上样缓冲液后，请加入Tris缓冲液直到其为中性（紫色）。

3）EDTA（Mn2+被螯合），钒酸，无机盐，表面活性剂等可引起条带弯曲或拖尾。4）空白泳道：空白泳道可能会导致条带弯曲。在空白泳道中加入等量的1x上样缓冲液。

5）钒酸：竞争结合磷酸可能导致条带弯曲。使用不同的磷酸酶抑制剂，或通过TCA沉淀或透析

6）将MnCl2添加到样品中（如终浓度1mM）可能改善结果。如果样品有EDTA残留，添加的Mn2+被螯合而不是凝胶中含有的Mn2+。