Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒或CCK8试剂盒，是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的 试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还 原生成橙黄色的 formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

酶标仪 (450 nm 滤光片)，96 孔板。 10 μl/ 100-200 μl 多通道移液器，细胞 CO2培养箱。

1. 将细胞悬液（100 μl /孔）接种在 96 孔板中。在潮湿的培养箱中预培养一定时间（例如，在 37℃，5％CO2下）。 2. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D. 值检测。 3. 将培养板放在培养箱中孵育 1-4 小时。 4. 使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

1. 在 96 孔板中每孔接种 100 μl 细胞悬液（约 5000 个细胞/孔）。将板在潮湿的培养箱中预培养 24 小时（例如，在 37℃，5％CO2下）。 2. 向孔中加入 10 μl 不同浓度的待测物质。 3. 将培养板在培养箱中孵育适当的时间长度（例如，6, 12, 24 或 48 小时）。 4. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D. 值检测。 5. 将培养板在培养箱中孵育 1-4 小时。 6. 在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。 如果不立刻测量吸光度，可在每个孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，盖好并在室温下避光保存。24 小时内不会观察到吸光度变化。

统计分析有几种方法，您可以选择使用 O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。 细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100 抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100 As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8 和待测化合物的孔的吸光度） Ab =空白孔吸光度（含有培养基和 CCK-8 的孔的吸光度） Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和 CCK-8 的孔的吸光度）

1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数

2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要 5-7 个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。 如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）

3. 培养直至细胞贴壁（通常 2-4 小时），然后每 100 μL 培养基加入 10 μL CCK-8。继续孵育1-4 小时，用酶标仪测量 450nm 处的吸光 度。制作出一条以细胞数为 X 轴坐标，O.D.值为 Y轴坐标的标准曲线。 可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

1. 确保药物和 CCK-8 均匀分布在培养基中。 

2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。 

3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要 1000 个细胞（100 μl 培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要 2500 个细胞（100 μl 培养 基）。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000. 如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整 CCK-8 的体积，使其为每孔总液体体积的10％。 

4. 因为 CCK-8 测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用 CCK-8 测定活细胞数之 间有差异。 

5. WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原 剂，需设法去除。

6. 孵育 2 小时后，背景 O.D.值一般为 0.1-0.2 单位。

7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰 O.D.值。

8. 如果您想对 CCK-8 溶液进行灭菌，请使用 0.2 μm 的膜过滤溶液。

9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达 4 小时）或大量细胞（~105细胞/ 孔）。 

10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在 600nm 或更高波长的 O.D 值。

11. CCK-8 不能用于细胞染色。 

12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。 

13. CCK-8的毒性非常低，在CCK-8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。 （除非细胞极为稀少，不推荐。） 

14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。 

15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。 

16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。

17. 如果您没有 450 nm 滤光片。您也可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之间的滤光片, 450nm 滤光片具有最佳灵敏度。

18. 测量 450 nm 处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定 650 nm处的吸光度。 

19. 药物中金属离子的存在可能会影响 CCK-8 的灵敏度。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、 15% 、 90% 的显色 反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM的话，将会 100% 抑制。