定量PCR（qPCR，又称Real-time PCR）是一种非常通用的的精确分析基因表达的技术。按方法不同可分为染料法和探针法两类，其中染料法更通用、更方便、成本更低。基于染料的qPCR法通过实时监测结合双链DNA的染料发射的荧光，可以在PCR的每个周期间接测量DNA扩增。当在某一个时间点上，检测到的荧光信号显著超过背景，就可以确定Ct值（Cq值）。所获得的Ct值可用于评估目标基因的相对丰度，也可根据适当的标准曲线计算绝对数量。该产品2X SYBR Green qPCR Master Mix在定量目标DNA或cDNA方面具有优越的特异性、强劲的扩增效率、理想的可重复性和稳定性。这是一个2X PreMix，使用了结合抗体的热启动Taq DNA聚合酶。理想的Taq聚合酶和合适的缓冲液保证了较好的特异性和较高的扩增速度。Mix中的SYBR Green I可嵌入双链DNA的双螺旋小沟区域，当它与每个周期扩增的双链DNA合时，会发出绿色荧光，通过仪器监测荧光可以实时的间接定量扩增产物。

该试剂与两种不同浓度的ROX染料一起提供，用于对应的仪器，用来校正仪器中不同反应之间的荧光信号强度。在进行实验时，使用SYBR或SYBR/FAM模式。

然而，染料法 qPCR 有一定的局限性。SYBR Green I 可以插入任何双链 DNA，如引物二聚体或其他非特异性的产物，导致非特异性产物发出荧光。为了确认产物的特异性，在扩增后，进行溶解曲线分析是必要的。在溶解曲线分析中，在引物退火温度附近出现一个尖峰是较为理想的实验结果。

Components 500 rxn (20 μl reaction)
2X SYBR Green qPCR Master Mix 1 mL x 5
50X ROX Reference Dye (low concentration) 0.2 mL
50X ROX Reference Dye (high concentration) 0.2 mL
将所有组分存放在-20°C并避光保存。尽可能避免反复冻融。

1. 建立 qPCR 反应体系
通过逆转录制备 cDNA 或通过 DNA 提取和纯化制备基因组 DNA。
为了获得最佳结果，我们建议每个样品至少重复三次。
1) 将 2X SYBR Green qPCR Master Mix、ROX 染料、模板、引物在室温下解冻，然后放到冰上。
完全解冻后，通过颠倒 EP 管或移液枪吹打使溶液分布均匀（如有必要进行离心以防止气泡）。
2) 根据反应的数量和每个反应的体积确定总体积，计算时注意超量 10%，准备除对应模板外的
所有组分的混合物。
3) 之后将混合物分入 qPCR 管或平板中。确保准确和一致的加样体积并尽量减少气泡。然后，
添加模板。
4) 使用光学透明的盖子密封 qPCR 管，光学透明的黏性膜密封 qPCR 板。注意密封好 qPCR 板的
边角，防止蒸发。
5) 充分混匀后，用离心机（几分钟，转速为 2500-3000 rpm）将所有反应物离心到孔的底部，消
除气泡（会干扰信号采集）。
*Note:
a. 使用不含模板的对照孔（No template control, NTC）来鉴定是否有污染。对照孔包含除模板外的所有反应
组分（2X SYBR Green qPCR Master Mix、引物、无核酸酶水），此孔不应返回明显的 Ct 值。
b. 使用稀释的 cDNA 或 DNA 作标准曲线，稀释应该在每次实验前准备。
qPCR 反应体系如下表所示：（如果使用不同于表格中的反应体积，按比例缩放所有组分。不推荐
使用小于 10 μl 的反应体系）1. 建立 qPCR 反应体系 通过逆转录制备 cDNA 或通过 DNA 提取和纯化制备基因组 DNA。 为了获得最佳结果，我们建议每个样品至少重复三次。 1) 将 2X SYBR Green qPCR Master Mix、ROX 染料、模板、引物在室温下解冻，然后放到冰上。 完全解冻后，通过颠倒 EP 管或移液枪吹打使溶液分布均匀（如有必要进行离心以防止气泡）。 2) 根据反应的数量和每个反应的体积确定总体积，计算时注意超量 10%，准备除对应模板外的 所有组分的混合物。 3) 之后将混合物分入 qPCR 管或平板中。确保准确和一致的加样体积并尽量减少气泡。然后， 添加模板。 4) 使用光学透明的盖子密封 qPCR 管，光学透明的黏性膜密封 qPCR 板。注意密封好 qPCR 板的 边角，防止蒸发。 5) 充分混匀后，用离心机（几分钟，转速为 2500-3000 rpm）将所有反应物离心到孔的底部，消 除气泡（会干扰信号采集）。 *Note: a. 使用不含模板的对照孔（No template control, NTC）来鉴定是否有污染。对照孔包含除模板外的所有反应 组分（2X SYBR Green qPCR Master Mix、引物、无核酸酶水），此孔不应返回明显的 Ct 值。 b. 使用稀释的 cDNA 或 DNA 作标准曲线，稀释应该在每次实验前准备。 qPCR 反应体系如下表所示：（如果使用不同于表格中的反应体积，按比例缩放所有组分。不推荐 使用小于 10 μl 的反应体系）

*Note: a. 在大多数反应中，可以使用 0.25 µM 的最终引物浓度。当反应效能较差，可以在 0.2-1 µM 之间调 整最佳引物浓度。 b. 当直接使用逆转录产物作为模板时，其体积不应超过最终反应混合物的 10%。向反 应体系中添加模板的数量取决于目标基因拷贝 的数量。一般情况下，每个反应使用 1-10 ng 单链 cDNA 或 10-100 ng gDNA。可以采用梯度稀释法确定最佳模板加入量。cDNA 模板通常应包含目标基因的

2. 启动 qPCR 反应 使用 SYBR®或 SYBR/FAM 模式设置 qPCR 仪，确保在延伸步骤结束时采集荧光信号。首选两步 法 qPCR 程序。如果 出现了较差的结果，如非特异性扩增过多或扩增效率低等，可调整反应组 分和条件或使用三步法 qPCR 程序。 1) 两步法 qPCR 程序：

*Note: a. 一般情况下预变性使用 95C 下 2 分钟，热激活 DNA 聚合酶。对于 GC 含量较高的目标序列，可 以适当延长预变性的时间。b. 延伸时间应根据实际使用的 PCR 仪所需的最小数据采集时间进行调整。如： 使用 ABI 7500 Fast / 7700 / 7900HT / 7900HT Fast / ViiA 7 / StepOne / StepOnePlus 时，将延伸时间设置为 30 秒；使用 ABI 7000 和 7300 时，将延伸时间设置为 31 秒；使用 ABI 7500 时，将延伸时间设置为 34 秒。 有 些 qPCR 仪可以使用更短的延伸时间，如 ABI StepOnePlus™仅需要 10 秒，Roche LightCycler / LightCycler 480 需要 20 秒，你可以根据你的目标序列长度和仪器要求来调整延伸时间。 c. 不同的仪器类型需要不同 的溶解曲线程序，按照实际使用的仪器确定溶解曲线程序。

2) 三步法 qPCR 程序：

注意事项 1. 引物设计 qPCR 实验设计的引物需要扩增效应好且非特异性产物少，可以遵循以下设计方针： 1) 目标序列长度：80-200 bp 较为合适。可以根据实际要求延长到 300 bp，在这种情况下，建议延长延伸 时间或 使用三步法。 2) 引物长度：17-30 bp。 3) GC 含量：40-60%（45-55%较为理想）。 4) Tm：正向引物和反向引物的 Tm 值不能有显著差异，Tm 值可以用软件计算。 5) 引物序列：A、T、C、G 分布最好较为均匀，避免 GC 或 AT 含量特别高的区域（特别是在 3 '端）， 避免聚嘧啶 （T/C 连续结构）和聚嘌呤（A/G 连续结构）。 6) 3'端序列：引物的 3'端 GC 和 AT 含量不能过高。我们建议选择在 3'末端为 G 或 C 的序列（避免 3' 末端为 T）。 3 个以上碱基的互补序列不能存在于引物中，也不能存在于引物对之间（分别造成发夹结构 或引物二聚体）。引 物对在每个 3'端上不应该有多于两个碱基的互补序列，以避免引物二聚体。 7) 特异性：通过软件确认引物的特异性。当设计引物时，在感兴趣的区域周围输入足够的序列。采用允许 对相关 序列数据库交叉参考的搜索标准（以避免潜在的扩增脱靶）。对于 cDNA 靶点，可以选择设计已知 剪接位点的引 物，以防止基因组 DNA 扩增。相反，针对内含子区域设计的引物可以确保只从基因组 DNA 进行扩增。 2. 模板制备及浓度 1) 长期储存时，为确保稳定性，模板 DNA 应储存在含 EDTA 的缓冲液（如 1X TE）中，用于 qPCR 实验 的稀释后的 溶液应新鲜配制，可使用 TE 或水稀释。 2) cDNA 可以来源于起始为 1 µg - 0.1 pg RNA 逆转录反应产物。cDNA 加入 qPCR 反应前可以不需要纯化， 但加入 前至少要 1:10 稀释。 / 5 / www.apexbt.com 3. 反应条件和循环条件 1) 对于 96 孔板我们建议使用 20 µl 反应体积。384 孔板建议 10 µl 的反应体积。 2) 在设置循环程序时，应确保在延伸步骤的末尾包含一个信号检测程序，并在最后进行溶解曲线分析，以 确定产 物的特异性。 3) 扩增 40 个循环对于大多数实验来说已经足够了，但是对于样本中拷贝量极低的目标基因，可以使用 45 个循环。