该产品2X High-Fidelity Master Mix能够为大部分PCR应用同时提供高保真性，强大的扩增能力和更快的扩增速度。该 DNA聚合酶增加了保真度和速度，高保真度使得DNA聚合酶成为分子克隆或其他后续应用的较优选择。其错误率比Taq DNA聚合酶低50倍，比Pyrococcus Furious DNA聚合酶低6倍。该DNA聚合酶具有5→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。它会在扩增产物两端产生平端，而没有A突出(A突出通常出现在用Taq聚合酶扩增的产物中)。在实验中我们的聚合酶能够扩增长达10 kb的片段。在PCR反应中， DNA聚合酶的延伸速率约为15-30 sec / kb(取决于基因的复杂性)。2X High-Fidelity Master Mix（With dye）是一种即用型2X 预混液，已经优化的缓冲系统和染料。 我们的产品适应于多种检测，PCR产物可以在扩增后直接进行电泳，而无需添加上样缓冲液。

如果后续实验是克隆，则产品2X High-Fidelity Master Mix（货号#J10005）不含染料版本是您更合适的选择。

将 master mix 储存于-20°C。

在冰上进行实验操作

我们建议将所有反应组分放在冰上。打开产品后确认全部解冻，以确保均一性。 由于该酶具有 3'→5'核酸外切酶活性，在缺乏 dNTP 的情况下也许可能降解引物，因此 2×High-Fidelity Master Mix 应最后添加到 PCR 混合物中。 由于DNA 聚合酶的性质，请注意使用DNA 聚合酶的实验操作指南，可能与其他聚合酶的指南不同。

a. 推荐的最终引物浓度为 0.4 μM，但可以在 0.2-1.0 μM 范围内变化，您可以调整浓度。一般推荐寡核苷酸引物长度在 20-40 bp 之间，理想的 GC 含量为 40-60％。

b. 使用高质量纯化的 DNA 模板可以大大提高 PCR 反应的成功率。对于低复杂度 DNA（例如质粒、病毒、λ 或 BAC DNA），DNA 模板量可以在每 50 μL 反应体积 1pg-10ng 之间。对于高复杂度的基因组 DNA，每50 μL反应体积 DNA 模板量应为 50-250 ng。如果从cDNA合成反应中获得模板DNA，则模板的体积不应超过最终PCR反应体积的10％。

轻柔的混匀反应体系，并在离心机中离心。

实验者应迅速将反应体系转移至预热至变性温度（98℃）的 PCR 仪。

如果 PCR 仪没有热盖，请使用矿物油覆盖样品。

a. 对于大多数模板，我们建议在98°C下进行1分钟的预变性。一些模板可能需要更长的预变性时间，预变性时间的长度可以延长达3分钟。

b. DNA聚合酶的最佳退火温度可能与基于Taq的聚合酶明显不同。DNA 聚合酶具有稳定引物模板杂交的能力。对于大多数模板，我们建议使用55-58℃的退火温度10-30秒。如有必要，使用温度梯度来找出每个模板—引物对组合的最佳退火温度。

c. 延伸时间取决于扩增子的长度和复杂性。对于低复杂度的DNA（例如质粒、病毒、 λ 或 BAC DNA），每1kb使用15秒的延伸时间。对于高复杂度的基因组DNA，建议每1 kb 30 秒。对于一些cDNA模板，延伸时间可以增加到每 1kb 40 秒，以获得最佳结果。对于大部分模板，每 1 kb 20 秒可以使用。

d. 当引物 Tm 值至少为 69℃（> 20 nt）或 72℃（≤20 nt）时，推荐使用两步法。在 2 步法中，即使当引物 Tm> 72℃时，组合退火/延伸步骤也应在 72℃下进行。

a. 该聚合酶退火温度不同于许多常见的 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）。有关于酶的退火温度的设置，我们推荐在 55-58℃。如果在该温度下，您无法获得较为理想的实验结果，可以尝试设置梯度退火温度，以优化实验条件。

b.使用 15-30 s / kb 的扩展速度。不要超过1分钟/ kb。

c. 该DNA 聚合酶产生平末端 DNA 产物。

d. 该酶的聚合能力较强，实验者在PCR的整个实验过程中请在冰上操作，否则室温下酶具有活性，有可能将引物聚合形成引物二聚体，引物消耗后，PCR 效率将会降低。