1. 适用样本齐全，植物组织叶片、种子、软茎、根。

2. 蛋白提取的率高，后续实验效果好。

3. 针对次生代谢产物多的样本，可有效确保蛋白的提取效率。

4. 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续操作。

4oC避光保存，12-18个月。

饱和硫酸铵甲醇溶液：向甲醇中添加硫酸铵，直到晶体析出

Tris 饱和酚：商品化试剂，Solarbio (厂家索莱宝，货号T0250)

BPP裂解液使用前需加蛋白酶抑制剂。（一定要添加，推荐cocktail形式的，货号A10004）

饱和硫酸铵甲醇溶液 向500ml甲醇中添加20g的硫酸铵，看到有晶体析出即可

Tris 饱和酚 Solarbio (厂家)

实验步骤

1）将样品放入预冷的研钵中进行研磨，期间不断加入液氮保持低温，动物样本反复研磨的总时长大约10分钟，植物样本反复研磨的总时长大约20分钟。

研磨结束后，将样品装管。

2）首次处理的样本按照下表中样品质量（g）：提取液

体积（mL）=1:5的比例加入BPP裂解液。已做过预实验的

样本，裂解液的添加比例可以参照预实验的结果。

3）如果加入裂解液后溶液呈半透明状水样（右图），不粘

稠，说明裂解液的比例合适，若溶液呈现样品的颜色（与研磨后粉末颜色相近）或者特别粘稠（旋涡震荡仪无法重悬液体），说明裂解液比例不合适，需要再添加裂解液；若裂解液比例达到1:10，溶液的颜色仍然没有改变，确认方法是否合适，同时检查裂解液的配制是否有问题。

4）置于涡旋震荡仪上震荡，至少5分钟，保证样品粉末在BPP裂解液中充分混匀，即肉眼观察无大于0.2cm²的块状固体，标准下图左；充分混匀后镜检标准如下图中。若超过5分钟后仍有块状固体未溶解（如下图右），需要镜检确定是否充分混匀。

5） 将混匀后的样品，放在4℃冰箱的垂直混匀仪上孵育裂解2个小时.

6） 孵育完成后，进行超声裂解，将超声仪的变幅杆插入样品溶液距离管底的1/3处，变幅杆不得倚靠管壁或者管底，呈悬空状态超声3秒~5秒，然后停顿10秒~20秒。超声时需要确保没有

气泡（探头在液面往下中间处），一旦产生气泡，需要立即停止并延长停顿时间，待气泡完全消去后，再继续进行超声，如此反复超声30次。

7）配平，12500rpm，高速冷冻离心机，4℃离心30分钟。

8）离心后的样品放至通风橱中，用移液枪缓缓吸取上清，转移至另一个干净的50mL圆底离心管中。原离心管中的沉淀需要保留，并暂存于4℃冰箱中，待实验成功后，再行丢弃。

9）在放入上清的50mL圆底离心管中，加入等体积的Tris-饱和酚，盖上管盖混匀，将样品放入高速冷冻离心机中，12500rpm，4℃，离心15分钟。

10）将离心后的蛋白样品，从高速冷冻离心机中取出，取出上清，转移到另一个干净的50mL圆底离心管中。在放有上清的50mL圆底离心管中，加入等体积的BPP裂解液，盖上管盖混匀，将样品放入高速冷冻离心机中12500rpm，4℃，离心15分钟。

11）将离心后的蛋白样品，从高速冷冻离心机中取出，放至通风橱取出上清，转移到干净的50mL锥底离心管或500mL塑料瓶中。此上清为蛋白粗提液。加入约5倍体积的饱和硫酸铵甲醇溶液于50mL离心管或500mL塑料瓶中，盖上瓶盖，上下颠倒混匀30次，将蛋白粗提液置于-20℃冰箱中，过夜沉淀。

12）将沉淀过夜后的蛋白粗提液，用移液枪分装到50mL圆底离心管中，每管的体积不得超过35mL。配平后放入高速冷冻离心机中，12500rpm，4℃，离心30分钟。

13）将离心后的蛋白粗提液，从高速冷冻离心机中取出，平缓移动，防止沉

淀悬浮。放至通风橱中，将上清缓缓倒掉，确保沉淀不滑

落，然后用移液枪将管内残留的溶液吸去并丢弃。

14）将步骤（13）得到的沉淀，转移至2mL离心管中。用

移液枪取1.5mL甲醇溶液加入其中，再用移液枪将沉淀吹

散成颗粒状（如右图）。然后将2mL离心管放入高速冷冻离

心机中，12500rpm，4℃，离心10分钟。

15）将2mL离心管，从高速冷冻离心机中取出，放至通风橱中，将上清缓缓倒掉，确保沉淀不滑落，然后用移液枪将管内残留的溶液吸去并丢弃。

16）用移液枪取1.5mL丙酮溶液加入到上一步15）得到的含有沉淀的2mL离心管中，用移液器将沉淀吹散成颗粒状，如图5。将离心管放入高速冷冻离心机中，12500rpm，4℃，离心10分钟。

17）将离心后的含有沉淀的1.5mL离心管，从高速冷冻离心机中取出。放至通风橱中，将上清缓缓倒掉，确保沉淀不滑落。然后用移液器将管内残留的溶液吸去并丢弃。将含有沉淀的1.5mL离心管开盖通风2分钟。期间确认无肉眼可见的丙酮溶液，且沉淀不能完全干透。通风2分钟后，立即盖上管盖。

18）蛋白复溶，将通风后的蛋白沉淀加入适量0.5%SDS。在0.5% SDS溶液中，用移液枪反复吹打沉淀，将沉淀吹散，使其最终均匀的分布在0.5% SDS溶液中（下图）。若蛋白仍不能完全溶解，则需要进行超声促溶。12500rpm离心10分钟，弃去沉淀，转移上清至另一个管中，此上清即为蛋白原液。

未澄清需超声 澄清状