中文名：蛋白分子之间的相互作用及植物三羧酸循环的代谢物通道

英文名：Protein-protein interactions and metabolite channelling in the plant tricarboxylic acid cycle

发表单位：德国马普所

杂志：Nature Communications，2017

影响因子：12.124

文献摘要：

连续代谢酶的蛋白质复合物，常被称为代谢区室，可以直接引导酶类之间的代谢物通路，从而增加对代谢途径通量的控制。然而支持它们在体内存在的实验证据仍然不完整。在目前的研究中，我们测试了组成植物三羧酸循环的蛋白之间的二元相互作用。然后我们集合（半）定量的全部数据结果，包括AP-MS质谱，split-LUC和酵母双杂交实验，生成了一套以评价蛋白分子相互作用的可信度评分系统。通过这种方法，我们鉴定了158组相互作用，包括连续酶的催化亚基之间以及调控非相邻反应的酶亚基之间的相互作用。我们通过同位素稀释实验，揭示了在分离的马铃薯线粒体中，柠檬酸盐和延胡索酸盐的代谢通道。这些实验数据为植物的三羧酸循环代谢区室提供了证据。

研究背景：

代谢区室，指的是连续代谢酶的超分子复合物，其作用是调节底物通道，即代谢通道。但是在植物中，只有生氰配糖体和糖酵解已被发现，而其他通道还未有实验数据支持。因此目前关于植物里代谢区室的阐述或实验证据还很不足。三羧酸循环在植物中是一种常见的代谢通道，其作用是产生NADH和有机酸类物质。而对于植物中的这一代谢通道，现有的实验数据并不完整清楚；相反的，在哺乳和酵母系统中，关于TCA循环作为代谢区室的可能性已经有了很多研究数据。所以这篇文章的研究目的旨在通过其他方法对这一代谢通道进一步进行更为深入系统的研究。

研究目的：

对38个调控TCA循环的线粒体蛋白，鉴定它们之间可能的关联性，以及使用不同方法测试蛋白之间的相互作用。

材料方法：

1. 实验材料

通过基因克隆表达，得到38个线粒体蛋白，其中包括三羧酸循环里的酶亚基和调控丙酮酸脱氢酶反应和旁路反应的相关线粒体蛋白。

2. 分析方法

38个线粒体蛋白分别进行AP-MS质谱分析，split-LUC和Y2H分析；并对其中的一部分蛋白分子进行双光子荧光互补实验（BiFC）及同位素稀释实验。

研究结果：

1. 植物TCA循环互作组的构建：使用了38个线粒体蛋白进行二元相互作用反应分析；分析方法分别是AP-MS质谱分析（图a），split-LUC（图b）和Y2H分析（图c）；然后把三种方法的数据结果进行整合，其中把AP-MS分析结果中，评分为3.9的互作蛋白对视为阳性组（图a）；在split-LUC数据中，把评分为3.7的互作蛋白对视为阳性组（图b）；在Y2H测试数据中，把接种后第3天或第5天观察到的克隆蛋白对视为阳性组（图c）。通过这种标准，在上述三种方法技术中发现分别有124, 126 和421组蛋白相互作用；其中有140个蛋白对是通过至少上述两种方法被发现的；11个蛋白对是在三种方法中都能被检测发现（图d）。然后对三种方法的结果进行整合，对每组蛋白的相互作用生成一个评分；对所有评分收集后，我们建立了一个类似于STATIS的数据模型，通过数据模型的特征分解，发现与LUC 和Y2H方法测得的互作数据综合评分相比，AP-MS数据的贡献是最少的（图e）。我们选取了所有超过综合评分临界值的蛋白对（158个）（图f），发现其中有84个蛋白对是与之前通过多种方法发现的140个蛋白对是重合的（图g）。

2. 调控连续反应的催化亚基相互作用：在TCA循环系统中（图a），一个蛋白复合体相当于一个蛋白子网络 。我们鉴定了312组类似的蛋白复合体，不仅捕获了一些已知的蛋白亚基的相互作用，包括PDC, ODC, SDH（图b, c, d）；另外，还有IDH亚基（图e）, SCoAL（图f），及之前报道过的异构体ME（图g）之间的相互作用。除此之外，我们通过上述方法还发现了一些新的相互作用，其中最重要的就是在TCA循环系统中调控连续反应的酶催化亚基之间的相互作用，包括延胡索酸酶(FUM) 1与苹果酸脱氢酶 (MDH) 2，MDH 1和2与CSY 4，CSY 4与ACO 2和3，及ACO 3与IDH 6（图g）。

这些数据进一步通过双分子荧光互补实验 （BiFC）得到验证。

3. 在分离的线粒体中，柠檬酸盐和延胡索酸盐的通道：虽然以上实验阐述了多组蛋白的相互作用，但是并未直接测试代谢通道。所以我们进行了同位素稀释实验，旨在获得代谢通道的相关信息。首先将线粒体从马铃薯块茎组织中分离出来，放在¹³C标记的底物中进行孵育，直至标记产物达到平衡。加入TCA循环中未标记的中间代谢物后，随时时间推移，监测标记产物的稀释效应。当代谢分子被引导时，通道中间产物和酶复合物周围环境会发生混合（这种混合影响是微不足道的），未标记的中间产物限制进入酶活性位点，那么产物中会缺乏¹³C标记稀释物分子。同时，为了达到实验目的，通过抑制某个反应实验，我们将TCA循环实现单向循环处理。

在这个实验中，¹³C标记的丙酮酸盐作为底物来测试柠檬酸盐和酮戊二酸的代谢通道。同时SDH反应途径被竞争性的丙二酸盐抑制，使得TCA循环实现单向循环，然后监测琥珀酸盐里的标记累计物（图4a）。当加入柠檬酸盐后，琥珀酸盐的稳定富集情况未发生变化（图4b）；但是当加入酮戊二酸后5分钟内，其富集情况开始减少（图4c）。在另一组实验中，将谷胺酸盐作为柠檬酸盐里的标记底物和累计物，测试琥珀酸盐，延胡索酸盐和苹果酸盐的代谢通道。同样的，使用非竞争性的氟代柠檬酸盐作为抑制剂抑制ACO反应，使得TCA循环实现单向循环（图4d）。加入琥珀酸盐后20分钟内，柠檬酸盐的富集开始减少（图4e）；加入延胡索酸盐后，富集情况未发生变化（图4f）；加入苹果酸盐后15分钟内，柠檬酸盐的富集有轻微的减少（图4g）。这些结果表明柠檬酸盐和延胡索酸盐被引导，而酮戊二酸，琥珀酸盐和苹果酸盐在植物线粒体中只是部分被引导。

创新点及启示：

1. 对多种方法的数据结果建立数据模型，进行多重交互分析

这篇文章通过不同方法进行测试，然后通过建立矩阵模型，对各种方法得到的数据进行交互分析，得到的数据结果更为准确可靠。

2. 蛋白复合体的关联分析

以蛋白复合体为单位进行的关联分析，如果通过抗体组进行分析，优势会更大，得到的数据会更准备完整。

抗体组分析优势：

1. 利用抗体组技术，可以研究植物在不同发育阶段或不同环境条件下的TCA循环的调控机制，从而可以在不同时空维度和不同环境下系统揭示TCA的调控机制动态变化。

2. 抗体组技术可以直接进行多维度功能验证，并且结果更可靠，包括差异蛋白的内源定量WB,定位IF，IHC实验等。

3. 利用抗体组进行复合体研究更加准确，通过CO-IP并结合质谱鉴定的方法可以解析该蛋白复合体和功能调控网络的形成。

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