中文名：受体酪氨酸激酶(RTKs)和蛋白磷酸酶(PP)互作组的整体解析

英文名：A Global Analysis of the Receptor Tyrosine Kinase-Protein Phosphatase Interactome

发表单位：多伦多大学唐纳利研究中心

杂志：MOLECULAR CELL，2017

影响因子：14.714

文献摘要：

受体酪氨酸激酶(RTKs)和蛋白磷酸酶(PP) 在细胞信号传导过程中起重要作用。本文利用MYTH 和 MaMTH 技术来绘制/描述人类细胞RTK和PP之间的蛋白相互作用图谱，超过 300 多个 RTK-PTP （PTP，蛋白质酪氨酸磷酸酶，是PP中一类）交互作用的结果被发现，鉴定到大量的前人为发现的RTK和PP之间的相互作用，此外发现PTP可以采用多种不同的蛋白互作形式来调节RTK信号传导。同时挑选了几个典型的RTK-PTP深入研究，PTPRH 和 PTPRB可以直接和EGFR互作使其去磷酸化来抑制其下游信号传导；PTPRA在EGFR信号传导中起双重作用，不仅与EGFR互作使其去磷酸化，而且通过激活ERC来增强下游ERK信号通路。总之，本文通过实验鉴定了大量RTK-PP互作信息，为RTKs 介导的信号通路研究提供一个更广泛，更深入的研究视角。

研究背景:

受体酪氨酸激酶(RTKs)可以接受细胞外各种信号（物理信号、化学信号、生物信号等），并传递到细胞内引起细胞产生生物学响应。信号传递过程发生异常，将导致机体产生混乱。因此，解析RTKs信号传递分子机制对了解许多疾病生理过程和研发新的预防和治疗手段都是至关重要的。人类基因组编码58个RTK（本文具体做了48个），RTK激活依赖于酪氨酸的磷酸化，同时RTK的酪氨酸也可以被蛋白磷酸酶（PP）去磷酸化，所以体内的RTK信号传递取决于酪氨酸的磷酸化/去磷酸化状态，而人体细胞内有144个PP（本文具体做了141个），系统研究RTK和PTP之间的相互作用将有助于研究RTK信号传导的分子机制。文章作者利用实验室先前建立的技术MYTH（膜蛋白酵母双杂交系统）和 MaMTH（哺乳动物膜蛋白双杂交系统）来绘制全基因组范围RTK-phosphatase（受体酪氨酸激酶-磷酸酶）互作组。

研究目的：

鉴定受体酪氨酸激酶(RTKs)和蛋白磷酸酶(PP)互作关系。

材料方法：

1. 实验材料及技术路线

MYTH——克隆人48个RTK基因cDNA，构建酵母诱饵载体（bait vector），克隆人体108个PP基因cDNA，构建酵母猎物载体（prey vector）杂交筛选（下左图）。

MaMTH——对MYTH试验有限制的RTKs和PP，采用此方法。克隆人ERBB 家族 4个RTK基因cDNA，构建诱饵载体，18个 RPTP基因cDNA构建猎物载体，转化HEK293T MaMTH reporter cells，采用荧光素酶活性分析试验进行筛选（下右图）。

2. 分析方法

MYTH（membrane yeast two-hybrid system）膜蛋白酵母双杂交系统

MaMTH（mammalian membrane two-hybrid system），哺乳动物膜蛋白双杂交系统）

研究结果：

1. MYTH技术分析RTK-PP互作组。下图B显示48个RTKs(横向)和108个PP（纵向）互作热图分析，总共鉴定到310个RTK-PP 互作蛋白对。下图C表示每一个bait蛋白，即与RTK蛋白的PP蛋白互作个数；下图D表示prey蛋白，即与PP蛋白的RTK蛋白互作个数。RTKs类蛋白AATK，PTK7,ERBB3和ROR2可以与多达30个及以上PP蛋白互作。同时PP类蛋白PPMs 和DUSP相比其它PP来说，也与更多的RTK蛋白互作，而且互作蛋白对的建立也是处在动态变化中，暗示RTK-PP互作本身是一个非常复杂的生物学过程。

2. MaMTH技术分析RTK-PP互作组：

MYTH技术检测RTK-PP互作组有局限性，剩余的18个PP与4个ERBB类RTKs 互作分析采用MaMTH 分析：根据荧光素酶实验的荧光信号强度与EGFR-SHC1（阳性对照）所发荧光信号对比分析，得出4个ERBB与18个PP蛋白互作强度数值（如下图），认为大于0.2的具有较强的互作关系，据此鉴定出9个RTK-PP蛋白互作对，即EGFR/PTPRA, EGFR/PTPRB, EGFR/PTPRH, EGFR/PTPRT, ERBB2/PTPRT, ERBB2/PTPRU, ERBB3/PTPRH, ERBB4/PTPRH, 和 ERBB4/PTPRT，并采用热图显示：

该实验也有瑕疵，既是0.2比值的选取并未有任何支持，那就会流失很多弱互作的蛋白对信息，对于瞬时产生互作关系的蛋白对也无法检测。

3. RTK-PP蛋白互作关系的验证：

无论是MYTH技术，还是MaMTH技术，总计得到314个RTK-PP蛋白互作对。需要进一步的验证，尤其是MYTH实验，是基于酵母双杂交实验得到的数据，更需要得到内源验证。

首先，本文鉴定出314个PPI，与前人检出的蛋白互作对比，本文发现更多的以前未知的蛋白互作关系。同时前人的互作蛋白在本文中有的也未检出，可能是因为构建载体上标签到时蛋白折叠/错误定位等引起蛋白状态不是天然状态所致。

其次，抽取部分RTKs-PP蛋白互作对，利用Co-IP进行内源验证，判断其正确性，如下图所示，构建11个Flag-PP载体转化HEK293细胞，利用Flag抗体做Co-IP，鉴定出7个互作蛋白，同时发现之前未有互作蛋白对Co-IP实验检测出互作关系，说明之前的互作结果关系需要经过进一步的验证才能进得到确认。

4. 挑选具体的蛋白互作PPI功能研究一：

PTPRH和 PTPRB蛋白磷酸酶直接与EGFR互作，使其去磷酸化进而抑制EGFR信号通路。如下图所示，通过Western blot实验检测在HEK293细胞系中过表达PTPRH和 PTPRB蛋白磷酸酶及对EGFR的影响，发现过表达PTPRH和 PTPRB导致细胞受到EGF激活后EGFR和ERK本该磷酸化状态增强，却发现其磷酸化状态（特异性位点和非特异性）减弱，呈现时间效应。同时，在OV-90细胞系中敲除PTPRH后发现，细胞受到EGF激活后EGFR和ERK，敲除PTPRH比对照该磷酸化状态增强。更进一步，对PTPRH重要氨基酸活性位点进行功能分析，发现氨基酸位点突变DACS后利用Co-IP鉴定EGFR特异性氨基酸位点的磷酸化程度，发现突变后Tyr1197位磷酸化程度比对照更多，说明PTPRH磷酸酶主要通过对EGFR的Tyr1197位磷酸化调节来调控EGFR介导的信号传递通路。

本部分实验设计严谨，对蛋白功能进行了深入的研究，特异位点的磷酸化抗体制备及实验结果非常成功，

通过定点敲除、过表达结合Western blot和Co-IP实验对PTPRH和 PTPRB的功能进行深入解析。

5. 挑选具体的蛋白互作PPI功能研究二：

本部分对PTPRA蛋白功能进行深入研究，揭示PTPRA在EGFR信号传递途径中的双重功能。一方面，PTPRA蛋白作为磷酸酶，与PTPRH和 PTPRB蛋白磷酸酶功能一样，对EGFR收到激发后磷酸化进行去磷酸化调节；另一方面，发现过表达PTPRA对下游RAS-ERK信号传递起到积极作用，进一步发现PTPRA的789位酪氨酸磷酸化状态对其功能有重要作用，该位点突变以后，PTPRA和SRC蛋白互作消失，说明其在蛋白互作中有重要作用。

创新点及启示：

1. 本实验开发的新技术平台MYTH（膜蛋白酵母双杂交系统）和 MaMTH（哺乳动物膜蛋白双杂交系统）来绘制全基因组范围RTK-phosphatase（受体酪氨酸激酶-磷酸酶）这类膜蛋白互作组，难度大，48*108=5184，5*18=90，总计5274个互作分析，数据工作量较大。

当然基于酵母的筛选技术有自身的缺陷，构建时有标签蛋白存在，可能会影响蛋白状态进而影响其互作，有太多假阳性，重要的是不是天然状态和材料不是人细胞，最好的做法就是直接使用受体酪氨酸激酶/磷酸酶抗体进行内源Co-IP，鉴定其互作关系，即可克服上述问题。

2. 蛋白功能深入分析

本文落脚点—选取了2到3个关键蛋白进行深入功能研究，采用遗传学手段（过表达/敲除）和Western blot ,Co-IP蛋白技术结合研究其功能，亮点在于实验严谨，同时有特异性成功抗体可以顺利地做磷酸化抗体检测，而蛋白特异位点的磷酸化抗体（修饰抗体）将是蛋白功能研究一大难题。

预先开发大规模的抗体库，不仅可以得到特定物种的抗体资源，从中也可筛选出大量蛋白修饰抗体，效率更高，时间更短，性价比更好。

综上，这篇文章绘制全基因组范围RTK-phosphatase（受体酪氨酸激酶-磷酸酶）膜蛋白互作组，并对其中2到3个蛋白进行了蛋白功能的深入研究，虽然其数据量并未十分巨大，但是本文是数据和功能研究相结合，在得到大量互作数据基础上，深入研究蛋白功能，因此才可发表高水平文章，得到的经过验证的结果也更加准确。

抗体组技术在此类文章中的优势：

1. 针对物种预先制备抗体组，理论上可涵盖该物种所有蛋白对应的抗体，筛选快、成功率高、覆盖度广。这样就是一个巨大优势，不需要针对某些蛋白单独定制抗体----难度大、成功率低。

2. 所有抗体全部是特异性高，不要额外构建标签抗体，可直接用于内源检测和验证，不但省去了转标签的麻烦，还消除了标签对蛋白的可能不当的影响，真正实现了蛋白Native状态的检测。

3. 针对亚细胞组分开发的抗体，可利用抗体进行大量的Co-IP实验，很方便地变可以鉴定蛋白复合体的构成和在不同生理状态下的动态变化，操作简单、直接、有效。

4. 蛋白互作组的研究是非常广泛的，网络中涉及到各种蛋白，实际试验中遇到Co-IP鉴定到很多蛋白，有一些的方法可能得不到所有蛋白抗体，而抗体组技术可以解决这个问题，可以拿到任何我们想要的蛋白的抗体，进行正反—相互验证试验，少走了很多弯路，也节省了时间和金钱。

5. 利用抗体组技术，我们可以随心所欲的研究任何我们想要研究的蛋白，对蛋白功能研究（定位，定量，互作，修饰等）做到游刃有余，得心应手。

6. 抗体芯片在筛选蛋白的修饰抗体方面有巨大的潜力和优势，虽然一次性成本较高，确实性价比最高的技术手段，整体来说仍然是大幅度降低抗体开发时间和成本，突破抗体需求的瓶颈。

原文下载：受体酪氨酸激酶(RTKs)和蛋白磷酸酶(PP)互作组的整体解析-原文.pdf