The Plant TPX2 Protein Regulates Prospindle Assembly before Nuclear Envelope Breakdown

发布时间：2017-09-12 浏览人次：发布人：

杂志：The Plant Cell，2008
影响因子：9.653（当年）
阅读人：牛宁宁

摘要：
TPX2（Targeting Protein for Xklp2）是真核细胞纺锤体组装核心调控蛋白，缺失会抑制纺锤体的组装和形成。脊椎动物的TPX2中包含一个特征结构域，而在植物中包含两个。植物TPX2在有丝分裂间期主要定位于细胞核内，而在分裂期、核膜崩溃之前就运输到纺锤体预定形成处、起始纺锤体的形成。分裂后期TPX2主要定位于纺锤体微管上和成膜体，在分裂默契迅速降解。研究者分析了拟南芥TPX2相关结构域，并证明将拟南芥TPX2可以转入爪蟾卵细胞、互补其缺失TPX2的缺陷。将TPX2抗体注入植物细胞中会影响有丝分裂进程。研究者通过以上结果证明了TPX2在核膜瓦解之前就开始起作用。

文章创新点：
1：由于文章发表时间很早，当时的植物学研究技术、抗体制备和检验技术、以及转基因技术都很有限。本文中巧妙的运用了当时已经非常成熟的爪蟾卵体外反应器技术进行检验，配合同样比较成熟的烟草叶片细胞系、和金缕梅雄蕊毛转化体系，分析了抗体的功能。
2：本文的优势在于证明了一个动植物体内相对保守的蛋白的功能也比较一致；分为两个层面：
1）拟南芥蛋白能够在爪蟾卵裂解液中起作用
2）抗人源蛋白的抗体能够识别拟南芥和其他植物蛋白，并且能够通过微注射拮抗植物蛋白

背景介绍：
在真核细胞中，有丝分裂过程中的染色体分离是通过纺锤体功能实现。纺锤体的装配来自于微管和微丝的装配。在动物提细胞中，中心体微管会形成类似篮子式的结构，使得核膜崩溃后染色体仍旧能够聚拢在相对集中的位置。分裂前中期，微管寻找染色体并附着；并在染色体上或者周围成核、与中心体发射出的微管形成共同的复合体，也就是说纺锤体源自反向平行的两组微管共同构成。成熟的卵母细胞中没有中心体，减数分裂的纺锤体仅由微管成核构成，聚集在染色体周围和纺锤体的两级。在爪蟾卵细胞提取物里放入DNA包被的珠子，也能看到这种微管聚合、形成类似纺锤体的过程。
高等植物细胞的纺锤体中不含有中心体，纺锤体的形成在细胞核核膜瓦解（nuclear envelope breakdown，NEB）之前就已经开始，即由呈星形仿射的微管组合而成。在NEB之后仍旧是染色体为中心形成纺锤体。脊椎动物纺锤体形成过程中，基于染色体的形成模式需要一系列Ran家族GTPase的功能，调控下游一系列蛋白的功能，包括TPX2就是其中之一。在分裂间期，TPX2定位在细胞核，NEB时被激活的RanGTP刺激importin-α和β释放，进而促进着丝粒附近的微管成核和延伸。在分裂后期结束的时候，TPX2重新定位于纺锤体中心部位，并随后降解，有丝分裂后的核膜才能重新组装。

实验结果
1：植物TPX2蛋白
首先分析拟南芥TPX2（AT1G03780）和人源TPX2的一级结构，发现相似度约<40%，包含2个TPX2特异性结构域，2个AURORA结合位点，1个细胞核定位结构（NLS）以及一个Xklp2靶位点（Fig.1A）。其中这2个TPX2特异性结构域在另外17个可以得到序列的植物中也有发现，然而在动物TPX2中仅有1个，植物中的第2个结构域与动物的结构域比较近似（Fig.1A）。

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Figure 1. T-Coffee Alignment of Arabidopsis and Human TPX2

2：全程AtTPX2定位于细胞核内，可以结合微管
利用人源TPX2和拟南芥TPX2特异性结构域能够识别多种植物TPX2（Fig.3A），在拟南芥幼苗、烟草细胞系等样本中能够检测到约65kD大小的条带。而拟南芥TPX2抗体能够识别100kD以上的条带。研究者构建了E-tag:GFP:At TPX2感染烟草叶片，分别用人源TPX2、GFP和E-tag抗体检验，发现正确条带应当是位于70kD以下的（Fig.3B-C）。
利用这两个抗体，研究者在烟草BY-2细胞中分别进行了免疫荧光检测，发现从分裂间期到G2后期，TPX2都能定位到核膜区域；在有丝分裂前期，TPX2定位在核周围；在整个有丝分裂期间，TPX2都定位在纺锤体上（Fig.3D）。而成膜体上自始自终没有TPX2的定位，这与之前TPX2在动物细胞中的定位是一致的。
进而研究者分析了AtTPX2在细胞分裂过程中不同时期的亚细胞定位，发现拟南芥根细胞里面，有65%的细胞中能够发现TPX2的定位，另外35%却没有，说明只有仍处于细胞周期内的细胞会合成TPX2。微管蛋白抑制剂（oryzalin or colchicine）和微丝蛋白抑制剂（latrunculin B）都不会破坏TPX2在细胞核内的定位，说明其入核运输并不是通过细胞骨架进行的，而是通过入核信号直接进行运输。而在BY-2细胞中过表达GFP:TPX2，在微管上也能观察到GFP信号，说明TPX2具有结合微管的能力。
G2期和有丝分裂前期，TPX2和组蛋白H2Ax的信号强度随着染色质逐渐固缩逐步增强；NEB开始之前，TPX2在5min内就可以从细胞核运输出去、并且定位在两级；NEB结束后，纺锤体逐步形成、伴随着TPX2的信号标记；从分裂后期开始，TPX2的标记伴随着着丝粒移动而逐渐缩短，但不会继续保留在纺锤体中新或者成膜体微管上（Fig.3J-K）。这些现象说明TPX2分布在细胞核周围微管、并在纺锤体形成和装配过程中起作用，但与成膜体形成、核膜形成没有关系。

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Figure 3. Expression and Dynamics of Full-Length At TPX2 in Various Plant Cells.

3：寻找决定AtTPX2核定位以及微管定位的关键结构域
对拟南芥TPX2进行不同长度的截短、并转染BY-2细胞，发现在220-303aa和610-758aa处包含核定位信号（Fig.4A），如果突变：KR231NG和KR673NG都会破坏核定位，而KR733NG不会影响核定位（Fig.4A）。另外220-463aa和684-758aa域TPX2的微管定位有关，其中220-303aa对定位更为必要（Fig.4B）。由于蛋白质运输通常要通过Crm1输出蛋白功能，研究者通过leptomycin B（出核抑制剂）处理，发现原本无法入核的TPX2 463-610aa片段在处理后也可以入核（Fig.5B）。

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Figure 4. Typical Expression Profiles of GFP:At TPX2 Domains in BY-2 Cells.

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Figure 5. Inhibition of Nuclear Export with Leptomycin B.

4：爪蟾卵提取物中，拟南芥TPX2能够促进微管的组装、结合Importin-α

研究者利用爪蟾卵提取物，分析了拟南芥来源的TPX2在动物细胞中的是否存在同样的功能。实验发现，没有TPX2的参与，RanGTP不能促进微管装配；只有加入了外源的爪蟾（Xl）或者拟南芥（At）TPX2，微管装配活动才能开始（Fig.6A-B）。已经有报道证明爪蟾对的TPX2能够与Importin-α结合；同样的，研究者证明拟南芥的TPX2也能与爪蟾中的Importin-α结合（Fig.6C）。以上研究结果证明，拟南芥TPX2蛋白能够接收RanGTP信号、引发微管的装配。

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Figure 6. Arabidopsis TPX2 Rescues Ran-Dependent Aster Formation in TPX2-Depleted Xenopus Egg Extract.

5：植物细胞中，可以通过注射TPX2抗体阻碍NEB过程和纺锤体形成
拟南芥TPX2抗体和人源TPX2抗体分别与tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)混合，微注射入金缕梅雄蕊毛细胞，确认了这个注射不会影响细胞基础形态和胞质环流等。通过与IgG注射组的对比，研究者发现在分裂间期注射的话，两种TPX2抗体都会导致细胞分裂异常，包括分裂前期停滞、或者延长等（Fig.7A-B）。部分（8个中的2个）在NEB后的分裂前期最后注射抗体的细胞，表现为分裂前中期受阻。而如果在分裂开始后的中期、后期和末期的注射，都不会对整个细胞周期进程产生任何影响（Fig.8）。这些结果证明，植物TPX2在有丝分裂前期末尾到前中期期间，纺锤体的组装过程中起到重要作用。

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Figure 7. Microinjection of Antibodies to TPX2 Inhibits the Onset of Mitosis.

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Figure 8. Mean Mitosis Transition Times for Microinjections with Antibodies and Dextran.

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