中文名：激活形式构象的Integrin β7是多发性骨髓瘤CAR-T免疫治疗的新靶点

英文名：The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma–specific target for CAR T cell therapy

发表单位：Osaka University

杂志：Nature Medicine, 2017

影响因子：30.357

解读人：李敏寅博士

摘要

基于单抗的免疫治疗的关键是寻找肿瘤细胞的靶点。本研究首先通过构建针对多发性骨髓瘤细胞的超过10,000个的单克隆抗体文库，并利用精巧的多部筛选方法，最后利用细胞流式分选法，从51个多发性骨髓瘤病人中找到了1个特异性靶点MMG49——激活形式的整联素β7 (integrin β7)。并且，通过各种细胞类型的流式分选，作者发现这个靶点在多发性骨髓瘤细胞中的特异性。而在肿瘤治疗方面，作者利用编码MMG49抗体胞外段改造的CAR-T细胞进行免疫治疗，CAR-T细胞能特异性识别多发性骨髓瘤细胞中的integrin β7，从而特异性杀死多发性骨髓瘤细胞，达到精确免疫治疗的目的。

研究背景

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是恶性浆细胞病，隶属于B细胞淋巴瘤的一种。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有免疫球蛋白或轻链过度生成，多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。多发性骨髓瘤虽然目前有一定的治疗方法，但容易复发。基于单抗的免疫治疗是未来多发性骨髓瘤治疗的潜在方法之一。本文利用了抗体组技术和基于细胞流式分选的方法，筛选出了新的多发性骨髓瘤的靶点，具有重要的临床治疗价值。

研究结果

1. 针对MM的单克隆抗体库的构建及筛选

作者首先使用经典的细胞杂交瘤技术构建了库容大于10,000个多种MM肿瘤细胞系的单克隆抗体文库。如何利用这个抗体文库进行biomarker的筛选作者提供了一种新的思路：用健康人（对照组）的外周血单核细胞(PBMC)对抗体库进行反向初筛，从中筛选出大约500个不能和对照组PBMC结合的抗体（图1-a）；再次，他们利用细胞流式技术，将对照组和病人组的骨髓细胞对这500个抗体再进行一次筛选，最终找到了一个单克隆抗体，MMG49（图1-a,b）。这个抗体能识别51个病人中的45个样品，也就是仅识别MM细胞(CD38+, CD45-)，而不识别白细胞(CD38-, CD45+)（图1-b,c）。

图1

2. MMG49单抗特异性识别激活形式构象的integrin β7

显然，接下来的工作便是鉴定出MMG49对应的抗原，找到特异性靶点。通过将MMG49阳性的MM细胞提取mRNA，构建cDNA文库，并利用病毒转染的方法转染到MMG49阴性的Ba/F3细胞系，通过MMG49流式分选富集这些MMG49阳性的细胞，PCR检测出插入片段对应的是integrin β7亚基的基因。再通过IP和ELISA，作者进一步验证了MMG49识别的抗原。作者还使用了细胞流式和integrin β7 KO的MM细胞系，进一步确认了MMG49识别的抗原是integrin β7。

图2

3. MMG49具有很强的细胞特异性

值得注意的是，前人的研究表明integrin β7也在PBMC中的多种细胞中表达，这与本研究的结果显是相互矛盾的。这一矛盾如何解释作者发现，MMG49并不单单识别一般构象的integrin β7，而是识别它的激活形式。通过比较识别一般构象的抗体FIB27和激活构象的抗体MMG49，可以发现，虽然FIB27识别B细胞、T细胞等其他免疫细胞，但MMG49几乎只特异性识别MM细胞。当在细胞系中加入Mn²⁺离子来激活integrin α4/β7，MMG49抗体的结合能力显著性增强。因此，作者找到了一种激活构象的integrin β7，是MM细胞的特异性膜蛋白标志物。

图3

4. 体外和体内实验表明MMG49 CAR-T细胞具有特异性杀伤MM肿瘤细胞的作用

通过把MMG49的可变区cDNA序列装在CD28和CD3-ζ的N端，将亚克隆有这一片段的慢病毒转染进T细胞中，作者构建出MMG49胞外段的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell, CAR-T)。作者验证了CAR-T细胞可以分泌IFN-γ和IL-2细胞因子，并能在体外特异性杀死MMG49抗原阳性的细胞。

图4

而在体内实验中，作者利用带有GFP荧光的MM.1S细胞系造模和生物体发光检测手段，发现MMG49 CAR-T细胞疗法能有效浸润骨髓组织，显著性降低减小骨髓瘤的体积，并实质性改善了肿瘤小鼠的存活率。

图5

亮点及启示

1. 利用抗体组和细胞流式分选技术筛选出骨髓瘤特异性的靶点

建立抗体组之后，可以有多种方法筛选特异细胞的靶点，比如芯片等定量方法。而本研究使用了细胞流式分选法，通过多部筛选的策略，找到了能特异性识别MM细胞的抗体。通过IP、流式和KO细胞，作者验证了这一靶点对应的抗原是integrin β7。因此，流式分选法和多步的筛选策略是寻找细胞膜蛋白标志物的有效手段。此外，在验证抗体识别的对应蛋白中，作者使用一系列严谨的验证手段，也是一个很值得借鉴的地方。

2. 激活形式的integrin β7是一种特异的骨髓瘤细胞标志物

根据前人的研究结果，作者发现MMG49识别的integrin β7在各种细胞中的表达并没有本研究中体现的特异性。为了解决这个疑问，作者定位了MMG49在integrin β7中的识别位点，恰好是在integrin β7胞外段负责构象变化的一段序列。因此，本研究为寻找肿瘤功能性靶点和免疫治疗提供了全新的思路。