2019年1月，中国农业科学院蜜蜂研究所李建科教授团队在蜂王浆高产相关研究中取得突破，并在知名蛋白质组学杂志Molecular Cellular Proteomics（五年IF=6.3）上发表文章，发掘了和咽下腺生产蜂王浆相关的功能蛋白和通路；其中用于验证蛋白质组学数据、并用于蛋白功能研究的一系列优质单克隆抗体，即来自该研究所与Abmart合作开发的Bee-mAbome：蜜蜂蛋白抗体库。小Mart在此和大家一起来分享解读这篇有趣的文章，也看看一个优质的单克隆抗体资源库，是如何助力蛋白质组学研究的。

文献信息：In-depth Proteome of the Hypopharyngeal Glands of Honeybee Workers Reveals Highly Activated Protein and Energy Metabolism in Priming the Secretion of Royal Jelly.

Hu Han, Bezabih Gebreamlak, Feng Mao, Wei Qiaohong, Zhang Xufeng, Wu Fan, Meng Lifeng, Fang Yu, Han Bin, Ma Chuan, Li Jianke.

Mol Cell Proteomics. 2019 Jan 7. doi: 10.1074/mcp.RA118.001257.

研究题目：对工蜂咽下腺深入的蛋白组学研究发现调控蜂王浆高产的蛋白及能量代谢相关通路

样本选择：遗传背景相同、蜂王浆产量存在巨大差异的高产蜂（浆蜂，RJB）和低产蜂（意蜂，ITB），取三个不同发育阶段（幼蜂，哺育蜂，采集蜂）的工蜂咽下腺，进行差异比较。

主要数据：基于质谱的差异蛋白质组学数据，亲和免疫学验证数据（Western blot，IHC），行为表型干涉+Western blot检测蛋白表达变化。

蜂王浆是一种含有多种活性成分的营养食品。世界上90%的蜂王浆由中国生产，这和我国的一种蜂王浆高产蜂种：浆蜂（下面研究中称为RJB）密切相关。浆蜂是从意大利蜜蜂（意蜂，下面研究中称为ITB）中选育出来的一支稳定品种，其蜂王浆产量是意蜂的10倍以上。此前关于蜂王浆分泌器官——咽下腺，尚无深入全面的蛋白质组学研究，对于浆蜂高产蜂王浆的调控机理是并不明确的。

本研究利用了蜜蜂的一个重要特征：即工蜂的发育是和其行为、社会功能密切相关的。青年工蜂（孵化后6~15天）行使哺育职责，称为哺育蜂（Nurse Bees，NB），这也是蜜蜂咽下腺生产蜂王浆最为旺盛的时期；15天以上的工蜂主要负责采集，称为采集蜂（Forager Bees，FB），蜂王浆分泌显著降低，咽下腺主要协助花蜜的转化贮存。该研究取咽下腺作为蛋白组研究对象，差异样本设置两个维度：1）不同发育时期——幼蜂（Newly Emerged Bees，NEB），哺育蜂，采集蜂；2）不同品种——浆蜂和意蜂。这6组差异样本（每组3重复）即用于LC-MS/MS质谱蛋白质组学分析。

1. 蛋白质组学分析结果：

经过数据过滤及比对，并且去掉已知得到435个蜂王浆分泌蛋白，本研究通过质谱共检测到在咽下腺表达的2375个蛋白。通过相关性分析及主成分分析，除了确认组内生物学重复良好之外，也发现不同品种的同一时期之间的蜜蜂咽下腺蛋白组近似程度很高，而不同时期的咽下腺蛋白组差异相对较大（下图）。

图中标记：NEB为幼蜂，NB为哺育蜂，FB为采集蜂；RJB为浆蜂（高产），ITB为意蜂（低产）。PCA分析中，RJB1和ITB1对应NEB，RJB10和ITB10对应NB，RJBF和ITBF对应FB。

按照器官分析在特定时期特异表达的蛋白并进行功能富集（上图），幼蜂（NEB）中富集到大量和腺体自身发育成熟可能相关的功能类别；哺育蜂（NB）中富集到了Ribosome，提示其咽下腺中有旺盛的蛋白合成需求；FB中富集到starch & sucrose metabolism，和花蜜转化贮存相关。

关注和蜂王浆合成最为相关的时期——NB时期，分析浆蜂和意蜂的咽下腺在这个时期的蛋白表达谱，共检测到了1501个蛋白。进行GO功能富集和KEGG通路富集分析后，下图展示了在浆蜂和意蜂中共同富集到（a）、只在意蜂中富集到（b）和只在浆蜂中富集到（c）的Go terms和通路，浆蜂中特异地富集到了ribosomal subunit，TCA cycle等和蛋白代谢、能量代谢相关的功能。进一步比较意蜂和浆蜂，在浆蜂中高表达的186个蛋白也富集到了蛋白合成相关的通路（d）。

阶段小结1：发掘蛋白组的数据可得到在蜂王浆高产的咽下腺样本里高表达的一系列和蛋白合成、转运、能量代谢相关的功能通路和功能蛋白。但蛋白组学数据需要配合更为细致的生化研究来确认蛋白差异表达的情况，本研究的亮点之一，即为丰富的基于抗体的验证数据——通过Western blot和IHC全面地展示关键蛋白在差异样本中的差异表达情况。

2. 基于抗体的蛋白差异表达验证结果：

由蛋白组学基础分析可以获得在NB时期特异富集的功能蛋白，以及在高产的RJB中特异富集的功能蛋白。这些蛋白多和蛋白质合成、能量代谢有一定的相关性。该研究选择了7个在NB时期特异高表达的蛋白（MRJP1，RpL13，RpL28，RpS26，RpS4，MDH，Lam）和1个在NEB时期特异高表达的蛋白（Hex110），经过Western blot验证得到的蛋白表达趋势和组学数据基本一致（下图左上）。

而在NB时期的浆蜂比意蜂高表达的蛋白中，本文也选取了10个蛋白进行Western blot验证（下图左下）。这10个蛋白的蛋白组学定量比较结果，以及Western blot验证的定量统计结果（均包含3次重复）展示在了下图右侧的图标中，可以看到和蛋白合成相关的核糖体蛋白RpL13, RpL28, RpS4, RpL4和能量代谢相关的UGP2, MDH以及gltA 均在组学数据和WB验证中表现出了显著的差异表达。

Western blot只能展示蛋白表达量的变化，而免疫组织化学实验（IHC）则可以更好地展示蛋白在细胞中的表达量和表达位置，从而结合组织微观形态的变化展示蛋白表达的差异。本研究中，首先使用蜂王浆蛋白MRJP1（下图红色荧光）和细胞骨架蛋白beta-actin（绿色荧光）展示了NB时期的咽下腺在结构上和其他时期（NEB，FB时期）的差异，哺育蜂的咽下腺中存在大量细胞骨架支撑的腺泡，和该时期发达的外泌功能密切相关。图中蓝色指示的是细胞核。

而通过IHC来检测在组学+Western实验中高表达的蛋白时发现，蜂王浆蛋白MRJP1和核糖体蛋白RpL13，RpL28，RpS4，RpL4均在浆蜂哺育蜂的咽下腺中表达水平更高：

阶段小结2：至此，在蜂王浆高产的NB时期、以及高产品种中高表达的功能蛋白，文中从组学和生化实验（Western blot，IHC）多方面验证了其表达的差异性。然而，这些数据仅能说明“在蜂王浆产量较高的咽下腺样本中，这些蛋白存在差异表达”，而不能证明蛋白表达是和蜂王浆的高产、而不是蜜蜂的年龄相关。要想获得文章的最终结论，必须要排除蜜蜂咽下腺蛋白组差异的年龄因素。这就需要接下来的表型干涉实验了。

3. 行为表型干涉证明蛋白表达差异与哺育行为而非年龄相关：

为了排除差异样本的年龄因素，该研究利用蜜蜂的社会学特征、以及药物干涉，分别制造了两种>15天的哺育蜂，从而获得了年龄相同、行为不同的采集蜂和哺育蜂群体。下图左侧展示了这种行为表型干涉的实验设计，两种特殊的哺育蜂分别为Reversed NBs（采集蜂变回哺育职责，样品标记为RN），以及Prolonged NBs（延长哺育行为的哺育蜂，样品标记为EO），对应同年龄段的采集蜂分别为CF和CF-EO。使用抗体检测咽下腺中相关蛋白的表达，并统计3次重复的Western blot定量结果，发现这些和蛋白合成、能量代谢相关的蛋白，其表达量是和哺育行为相关而非年龄相关。这一重要的功能实验将蛋白差异直接和分泌蜂王浆的哺育功能链接起来，从而更严谨地阐述了蛋白及能量代谢通路在蜂王浆高合成的咽下腺中是高度活跃的。

总结： 本文从蜂王浆高产蜂、低产蜂的咽下腺发育蛋白组切入，结合质谱蛋白组学、Western blot和IHC，行为表型干涉功能相关性实验，发掘并验证了和蜂王浆高产相关的功能蛋白。层层递进的分析和丰富的验证数据大大提升了数据的严谨性和结论的特异性，从而讲了一个有趣的好故事。然而熟悉生化研究的小伙伴们肯定会有一个疑问：

市场上非常缺乏蜜蜂的目录抗体，本文这么大量的生化验证实验数据，如何获得的稳定可靠的抗体呢

在本研究中涉及到的单克隆抗体，除了MRJP1之外，均来自该研究所和Abmart的平台式合作项目——蜜蜂单克隆抗体库项目。此类抗体库采用Abmart技术，通过非靶向建库的方式，可以以极低的平均成本构建上万单克隆抗体。此后结合特异的生物学问题，即可同时筛选差异蛋白及差异蛋白对应的单克隆抗体。在这个案例里，验证组学数据、进行功能相关性研究所用到的单克隆抗体，只是已鉴定抗体的一小部分哦~ 这些单克隆抗体由于其高度的可重复性和可再生性，不仅可以结合组学数据发表优质的文章，还可以源源不断地支持相关领域的研究在深度和广度上发展，可谓是“抗体库在手，蛋白研究不愁”啦。怎么样，你是否也想好如何构建或者使用属于你的抗体库，来提升组学研究和其他蛋白功能研究了呢