文章来源：BioArt 2020-03-15   https://mp.weixin.qq.com/s/1sULI21zahiK1rTGpPbhIQ

点评 | 朱衡 教授（ Johns Hopkins大学）

  责编 | 酶美

抗体作为一类重要的生物亲和试剂，在生命科学研究和医学相关研究中不可或缺【1】。在高通量核酸测序技术的强大测序能力的推动下，目前已有大量物种的基因组被完全测序。针对这些物种，需要大量的抗体来推动后续研究【2】。但常规抗体制备技术费时，费力且耗费不菲，一般一次只能制备一种抗体，无法满足在较短的时间内获得大量抗体的迫切需求【3】。

2020年3月11日， Science Advances 在线发表了上海交通大学陶生策团队和西北大学/Abmart公司孟逊团队合作的最新研究成果：An Array of 60,000 Antibodies for Proteome-Scale Antibody Generation and Target Discovery。本文介绍了团队开发的高通量抗体筛选芯片，并以此进行了多物种间多靶标蛋白抗体的筛选。

本文研究开发了一款包含62,208种单克隆抗体的超高通量抗体芯片，并利用抗体的多特异性（multi-specificity）去发现和寻找新抗体。该芯片被用于了蛋白质组水平的抗体制备、表型相关蛋白质筛选以及肿瘤药物靶向蛋白的发现等。这些单克隆抗体的免疫原来自400+类物种的3000+种蛋白质的15000+个线性表位，通过30000+万只小鼠的免疫、骨髓瘤细胞融合和筛选，最终形成了一个具有高度多样性、经过亲和力成熟的抗体库（图1）。

本研究基于所建立的抗体库，构建了超高通量的抗体芯片，包含62208种单克隆抗体，并联合质谱建立了规模化抗体制备以及鉴定表型相关蛋白质的技术。首先，研究人员建立了规模化抗体制备的流程。基于高通量抗体芯片进行细胞膜蛋白或核蛋白提取物的分析，然后采用pull-down联合质谱逐一鉴定阳性抗体所识别的抗原（图2）。

基于该方法，研究者一次获得了针对107个膜蛋白的149个单抗以及针对42个核蛋白的55个单抗。随后，对这些抗体进行了严格的特异性评估，并证明可适用于IF以及ChIP-Seq等应用 (图3)。同时，研究人员发现该技术路径可广泛应用于规模化制备其它多个物种的抗体，目前已测试了超过10个物种；第二，用以鉴定表型相关蛋白质。通过比较特定表型与对照之间的芯片信号差异以获得抗体，并采用相同的方法鉴定抗原。研究人员成功地鉴定了19个与玉米发育相关的蛋白质，以及6个与斑马鱼心脏损伤相关的蛋白质。这种技术的优势在于可在鉴定到关键蛋白的同时获得高质量的单克隆抗体，用以后续的验证和功能实验。第三，用以获得抗肿瘤抗体药物的同时鉴定肿瘤靶标蛋白。研究人员基于肺癌和癌旁组织进行差异筛选，针对阳性抗体进行肿瘤细胞内吞和毒性实验等功能验证，获得4个具有肿瘤特异杀伤作用的抗体，并鉴定了其靶标蛋白。其中，针对CD44v9的单抗Pb44707进行了细胞水平和小鼠模型等多层面的验证，发现该抗体具有较好的抗肿瘤药物潜力。

综上所述，该研究所开发的超高通量抗体芯片及所建立的方法在概念是一种突破，充分利用了抗体的多特异性来发现新的抗体，以前虽有零星的相关研究，但只有本研究第一次提供了一个可行的实现途径。在该研究之前的抗体芯片一张芯片一般最多包含~1000种抗体，本研究是其的~60倍，在技术也是一个很大的进步。该研究所建立的抗体芯片可广泛用于规模化抗体制备、表型相关蛋白的鉴定以及治疗抗体和靶标蛋白的发现等领域。

本项研究的共同第一作者是西北大学/Abmart王朝晖博士、上海交通大学博士研究生李阳、西北大学/Abmart/德琪医药侯冰博士、以及美国杜克大学的Mira I. Pronobis. 西北大学/Abmart孟逊博士和上海交大陶生策研究员为本文通讯作者。

Heng Zhu（朱衡）（Johns Hopkins大学教授）

抗体是重要的科学研究工具，亦在疾病治疗上具有广泛的应用。高效、低成本地制备高质量的单克隆抗体仍面临诸多挑战。抗体通常通过抗原免疫和抗体展示库筛选两种方式获得。前者以免疫动物为代价，效率低、成本高；后者以phage/yeast display为代表，是未来的发展方向。然而，抗体展示库通常以抗体混合物的形式存在，制备特定抗原的抗体需要多轮淘选进行富集、亲和力成熟，并需要抗体基因测序鉴定和抗体重组表达，工作量较大。抗体芯片技术将成千上万种不同的抗体独立地固定在基片表面，既允许一定规模的抗体库的容量，又消除了抗体之间的干扰和竞争，因此让筛选过程变得直接、高效、可靠。近年来，蛋白质芯片制备技术取得了显著的进展，单张芯片可容纳5-10万种蛋白或抗体，使得容纳经过设计的、浓缩的抗体库成为可能。

陶生策团队与孟逊团队联合发表的这篇文章正是基于该策略，提供了一种全新的抗体制备和蛋白质组研究的思路。他们首先构建了一个抗体库，但该抗体库并非传统的噬菌体展示库，而是经过大量多肽免疫、亲和力成熟及筛选的单克隆抗体库，多样性在10^ 5水平。有意义的是，这些多肽并非随机产生，而是来源于各种蛋白质表面的、具有较强免疫原性的表位（epitope），代表自然界真实存在的、广泛的抗原表位，形成了一个高度多样性的“表位组”，所得到抗体库亦可认为是经过筛选的、有效抗体富集的抗体库。将如此规模的抗体库与蛋白质芯片技术结合，即可实现将每个抗体完全分离，从而使得针对特定抗原的抗体筛选过程变得极为便捷。重要的是，这种便捷性提供了另外一种可能，即并行筛选多种蛋白质的混合物，并联合质谱对抗原进行反向鉴定，实现高通量抗体组的制备。在此基础上，可作为筛选工具轻易地获得某种表型特异的抗体，进而反向鉴定其所识别的差异抗原。这个独特的技术优势开拓了一种蛋白质组研究的新思路，特别是提供了一种发现和鉴定肿瘤抗原的新策略。

该项工作提供了超高通量的抗体库芯片，一张芯片上覆盖了62208种单克隆抗体，代表了抗体芯片领域当前的最高水准，并基于大量的实验数据展示了多种可能性。我相信这项新技术将对于抗体的规模化制备和蛋白质组学的研究起到重要的推动作用。

2. K. P. Koepfli, B. Paten, S. J. O'Brien, The Genome 10K Project: a way forward. Annual review of animal biosciences 3, 57-111 (2015).

3. Stoevesandt, O. & Taussig, M.J. Affinity proteomics: the role of specific binding reagents in human proteome analysis. Expert Rev Proteomics 9, 401-414 (2012).