产品高保真 DNA 聚合酶能够为大部分 PCR 应用同时提供高保真性,强大 的扩增能力和更快
的扩增速度。高保真度使得 DNA 聚合酶成为克隆或其他后续 应用的较优选择。该款 DNA 聚
合酶是具有最高的准确性的 DNA 聚合酶中的一个,其错误率比 Taq DNA 聚合酶低 50 倍,比
Pyrococcus Furious DNA 聚合酶低 6 倍。该 DNA 聚合酶具有 5→3'聚合酶活性和 3'→5'外切酶
活性。它会在扩增产物两端产生平端,而没有 A 突出(A 突出通常出现在用 Taq 聚合酶扩增的
产物中)。在实验中该聚合酶能够扩增长达 10 kb 的片段。
本产品包含有 DNA 聚合酶(1 U /μL)和 5X HF 缓冲液(已添加 Mg2 +), 50 mM 额外的 MgCl2
溶液,以及 DMSO(100%)。
在冰上进行实验操作
我们建议将所有反应组分放在冰上。实验者应在打开产品前仔细混合和离心所有管子,以确保均一性和改善回收率。因为储存缓冲液中含有高甘油含量,应该小心轻柔地移取该聚合酶。由于该酶具有 3'→5'核酸外切酶活性,在缺乏 dNTP 的情况下也许可降解引物,因此该DNA 聚合酶应最后添加到 PCR 混合物中。 由于该DNA聚合酶的性质,请注意使用该DNA聚合酶的实验操作指南,可能与其他聚合酶的指南不同。
a. 推荐的最终引物浓度为 0.4 μM,但可以在 0.2-1.0 μM 范围内变化,您可以调整浓度。一般推荐寡核苷酸引物长度在 20-40 bp 之间,理想的 GC 含量为 40-60%。
b. 对于富含 GC 的扩增子,建议添加 DMSO。对于 GC 含量非常低或扩增子> 20 kb 的扩增 子,不建议使用 DMSO。
c. 使用高质量纯化的 DNA 模板可以大大提高 PCR 反应的成功率。对于低复杂度 DNA(例如质粒、病毒、λ 或 BAC DNA),DNA 模板量可以在每 50 μL 反应体积 1pg-10ng 之间。对于高复杂度的基因组 DNA,每50 μL反应体积 DNA 模板量应为 50-250 ng。如果从cDNA合成反应中获得模板DNA,则模板的体积不应超过最终PCR反应体积的10%。
d. 聚合酶的最佳加入量取决于模板的量和PCR产物的长度。每50μL反应体积通常使用1U DNA 聚合酶将会产生良好的结果,但是根据扩增子的长度和难度,每50μL反应体系的最佳量可以在 0.5到1U之间。不建议超过2U/50μL(0.04U/μL),特别是对于长度超过5kb的扩增子。
e. DNA聚合酶应该使用高质量的dNTP进行扩增。聚合酶不能读取模板链中的dUTP-衍生物或 dITP,因此不建议使用这些类似物或含有它们的引物。
f. Mg2 +已经被加入到缓冲液中,实验者不需要重复添加 Mg2 +。如果存在螯合剂(例如 EDTA),或者您想要进一步提高酶的活性,则可能有必要另外添加Mg 2+。Kit中有额外的MgCl2溶液提供。5×HF buffer中Mg2+的浓度为10 mM, 即在最终反应体系中Mg2+浓度为2 mM。
轻柔的混匀反应体系,并在离心机中离心。
实验者应迅速将反应体系转移至预热至变性温度(98℃)的 PCR 仪。
如果 PCR 仪没有热盖,请使用矿物油覆盖样品。
a. 对于大多数模板,我们建议在98°C下进行1分钟的预变性。一些模板可能需要更长的预变性时间,预变性时间的长度可以延长达3分钟。
b. DNA聚合酶的最佳退火温度可能与基于Taq的聚合酶明显不同。DNA 聚合酶具有稳定引物模板杂交的能力。对于大多数模板,我们建议使用55-58℃的退火温度10-30秒。如有必要,使用温度梯度来找出每个模板—引物对组合的最佳退火温度。
c. 延伸时间取决于扩增子的长度和复杂性。对于低复杂度的DNA(例如质粒、病毒、 λ 或 BAC DNA),每1kb使用15秒的延伸时间。对于高复杂度的基因组DNA,建议每1 kb 30 秒。对于一些cDNA模板,延伸时间可以增加到每 1kb 40 秒,以获得最佳结果。对于大部分模板,每 1 kb 20 秒可以使用。
d. 当引物 Tm 值至少为 69℃(> 20 nt)或 72℃(≤20 nt)时,推荐使用两步法。在 2 步法中,即使当引物 Tm> 72℃时,组合退火/延伸步骤也应在 72℃下进行。
如果需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,我们的产品SYBR Safe DNA Gel Stain(货号:J10003) 该产品安全低毒,推荐您选择使用。
Note: Application as IHC, only suitable for histochemical staining or fluorescence staining of paraffin-embedded sections. Application as ICC/IF, suitable for histochemical or fluorescent staining of frozen sections, as well as chemical and fluorescent staining at the cellular level.
注意:抗体应用为IHC的,抗体只适合于石蜡切片的组化染色或者荧光染色。
抗体应用为IF/ICC的,抗体适合于冰冻切片的组化染色或者荧光染色,以及细胞水平的化学染色和荧光染色。
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