该产品2X High-Fidelity Master Mix能够为大部分PCR应用同时提供高保真性,强大的扩增能力和更快的扩增速度。该 DNA聚合酶增加了保真度和速度,高保真度使得DNA聚合酶成为分子克隆或其他后续应用的较优选择。其错误率比Taq DNA聚合酶低50倍,比Pyrococcus Furious DNA聚合酶低6倍。该DNA聚合酶具有5→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。它会在扩增产物两端产生平端,而没有A突出(A突出通常出现在用Taq聚合酶扩增的产物中)。在实验中我们的聚合酶能够扩增长达10 kb的片段。在PCR反应中, DNA聚合酶的延伸速率约为15-30 sec / kb(取决于基因的复杂性)。2X High-Fidelity Master Mix(With dye)是一种即用型2X 预混液,已经优化的缓冲系统和染料。 我们的产品适应于多种检测,PCR产物可以在扩增后直接进行电泳,而无需添加上样缓冲液。
如果后续实验是克隆,则产品2X High-Fidelity Master Mix(货号#J10005)不含染料版本是您更合适的选择。
将 master mix 储存于-20°C。
在冰上进行实验操作
我们建议将所有反应组分放在冰上。打开产品后确认全部解冻,以确保均一性。 由于该酶具有 3'→5'核酸外切酶活性,在缺乏 dNTP 的情况下也许可能降解引物,因此 2×High-Fidelity Master Mix 应最后添加到 PCR 混合物中。 由于DNA 聚合酶的性质,请注意使用DNA 聚合酶的实验操作指南,可能与其他聚合酶的指南不同。
Components | 20 μl reaction | 50 μl reaction | FINAL CONCENTRATION |
ddH2O | add to 20 μL | add to 50 μL | |
10 μM Forward Primer | 0.8 Μl | 2 μL | 0.4 μM |
10 μM Reverse Primer | 0.8 μL | 2 μL | 0.4 μM |
Template | Variable | variable | < 250 ng |
2×High-Fidelity Master Mix | 10 μL | 25 μL |
a. 推荐的最终引物浓度为 0.4 μM,但可以在 0.2-1.0 μM 范围内变化,您可以调整浓度。一般推荐寡核苷酸引物长度在 20-40 bp 之间,理想的 GC 含量为 40-60%。
b. 使用高质量纯化的 DNA 模板可以大大提高 PCR 反应的成功率。对于低复杂度 DNA(例如质粒、病毒、λ 或 BAC DNA),DNA 模板量可以在每 50 μL 反应体积 1pg-10ng 之间。对于高复杂度的基因组 DNA,每50 μL反应体积 DNA 模板量应为 50-250 ng。如果从cDNA合成反应中获得模板DNA,则模板的体积不应超过最终PCR反应体积的10%。
轻柔的混匀反应体系,并在离心机中离心。
实验者应迅速将反应体系转移至预热至变性温度(98℃)的 PCR 仪。
如果 PCR 仪没有热盖,请使用矿物油覆盖样品。
a. 对于大多数模板,我们建议在98°C下进行1分钟的预变性。一些模板可能需要更长的预变性时间,预变性时间的长度可以延长达3分钟。
b. DNA聚合酶的最佳退火温度可能与基于Taq的聚合酶明显不同。DNA 聚合酶具有稳定引物模板杂交的能力。对于大多数模板,我们建议使用55-58℃的退火温度10-30秒。如有必要,使用温度梯度来找出每个模板—引物对组合的最佳退火温度。
c. 延伸时间取决于扩增子的长度和复杂性。对于低复杂度的DNA(例如质粒、病毒、 λ 或 BAC DNA),每1kb使用15秒的延伸时间。对于高复杂度的基因组DNA,建议每1 kb 30 秒。对于一些cDNA模板,延伸时间可以增加到每 1kb 40 秒,以获得最佳结果。对于大部分模板,每 1 kb 20 秒可以使用。
d. 当引物 Tm 值至少为 69℃(> 20 nt)或 72℃(≤20 nt)时,推荐使用两步法。在 2 步法中,即使当引物 Tm> 72℃时,组合退火/延伸步骤也应在 72℃下进行。
a. 该聚合酶退火温度不同于许多常见的 DNA 聚合酶(如 Taq DNA 聚合酶)。有关于酶的退火温度的设置,我们推荐在 55-58℃。如果在该温度下,您无法获得较为理想的实验结果,可以尝试设置梯度退火温度,以优化实验条件。
b.使用 15-30 s / kb 的扩展速度。不要超过1分钟/ kb。
c. 该DNA 聚合酶产生平末端 DNA 产物。
d. 该酶的聚合能力较强,实验者在PCR的整个实验过程中请在冰上操作,否则室温下酶具有活性,有可能将引物聚合形成引物二聚体,引物消耗后,PCR 效率将会降低。
Note: Application as IHC, only suitable for histochemical staining or fluorescence staining of paraffin-embedded sections. Application as ICC/IF, suitable for histochemical or fluorescent staining of frozen sections, as well as chemical and fluorescent staining at the cellular level.
注意:抗体应用为IHC的,抗体只适合于石蜡切片的组化染色或者荧光染色。
抗体应用为IF/ICC的,抗体适合于冰冻切片的组化染色或者荧光染色,以及细胞水平的化学染色和荧光染色。
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