First-Strand cDNA Synthesis Kit是基于Reverse Transcriptase从Total RNA或Poly(A)+RNA合成 第一链cDNA的试剂盒。Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H- ) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程 改造后获得的全新逆转录酶,相较而言Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。 Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度,适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外,Reverse Transcriptase增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录,可合成长达12.3 kb的第一链cDNA。 First-Strand cDNA Synthesis Kit包含合成第一链cDNA所需的所有组分,并提供Random Primers
RT SuperMix for qPCR是基于Reverse Transcriptase的逆转录反应预混液。Reverse Transcriptase 是在 M-MLV (RNase H- ) Reverse Transcriptase 基础上经过基因工程改造后获得的全新逆转录酶,相较而言 Reverse Transcriptase 降低了 RNase H 活性且大幅度提高了热稳定性。Reverse Transcriptase 可耐受更高的反应温度,适用于具有复杂二级结构的 RNA 模板的逆转录。
RT SuperMix for qPCR 适用于两步法 qRT-PCR 检测,5×SuperMix 中含有逆转录所需的所有成分,加入模板 RNA 和 RNase Free ddH2O 就可以迅速进行反应。RNA 模板的体积最多可加到总体积的 80%,非常适合于低浓度 RNA 模板的逆转录反应。5×SuperMix 在-20℃不会冻结,使用方便。 本产品针对 qPCR 进行特别优化,经过比例优化的 Oligo (dT)23VN primer mix/Random primers,使 cDNA 合成可从 RNA 转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率,最大程度保证了 qPCR 结果的真实性和可重复性。逆转录产物适用于 SYBR Green 和探针法 qPCR,可以根据实验目的,选择相应的试剂配合使用,进行高性能的基因表达分析。
将所有组分存放在-20℃并避光保存。
Components | 50 rxn (20 μl reaction) |
RNase Free ddH2O | 1 mL |
5 X RT SuperMix | 200 μl |
5 X No RT control Mix | 20 μl |
将所有组分存放在-20℃并避光保存。
在 RNase free 的 PCR 管中配制如下混合液。
Component | Volume |
模板 RNA | Total RNA: 1 pg - 1 μg |
5 x SuperMix | 4 μl |
RNase-free Water | Up to 20 μl |
No RT Control 反应(可选) No RT Control 是指不加逆转录酶的逆转录阴性对照反应,用于检验 RNA 模板中是否有基因组 DNA 残留。 在 RNase-free 离心管中配制如下混合液:
Component | Volume |
模板 RNA | Total RNA: 1 pg - 1 μg |
5 x No RT control Mix | 4 μl |
RNase-free Water | Up to 20 μl |
轻轻混匀上述反应物,瞬时离心,按下表设置逆转录程序:
Temperature | Time |
25°C | 2 min |
42-50°C | 15 min |
95°C | 1 min |
注:Reverse Transcriptase 对具有复杂二级结构的 RNA 模板仍具有良好的扩增能力,因此通常建议在 42°C 进行反应,也可以在 45-50°C 进行反应,以便减少非特异性扩增和提高产量。
得到的逆转录产物可立即用于 qPCR 反应,也可分装后于-20°C 短期保存,-80°C 长期保存,避免反复冻融。
1. 实验在冰上操作,过程中避免RNase污染。
2. RNA的纯度会影响cDNA的合成量,RNA提取过程应注意防止RNA降解。
3. 5 × SuperMix及5 × No RT Control Mix含有高浓度的甘油,在使用前请短暂离心收集到反应管底部,并用移液器 轻轻吸打充分混匀后,准确吸取。
4. 对于20 μl逆转录反应体系,建议加入不超过1 μg的Total RNA,如果目的基因表达量非常低,最多加入5 μg total RNA, 否则加入RNA量过高,可能会超出后续定量PCR的线性范围。
5. 如果加入RNA模板体积较大(如超过2 μl),请确保RNA是溶于水中而不是TE中,因为TE中的EDTA会对逆转录反应产生抑制。
6. 如果在qPCR实验中发现No RT Control与实验组之间的CT值差< 5,则说明RNA模板有可能受到基因组DNA的污染。
7. cDNA产物仅适用于qPCR反应,不适用于克隆等下游实验的长片段PCR扩增。如有需要,推荐使用First-Strand cDNA Synthesis Kit或者First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(货号J10002和J10007)。
Note: Application as IHC, only suitable for histochemical staining or fluorescence staining of paraffin-embedded sections. Application as ICC/IF, suitable for histochemical or fluorescent staining of frozen sections, as well as chemical and fluorescent staining at the cellular level.
注意:抗体应用为IHC的,抗体只适合于石蜡切片的组化染色或者荧光染色。
抗体应用为IF/ICC的,抗体适合于冰冻切片的组化染色或者荧光染色,以及细胞水平的化学染色和荧光染色。
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