本产品是特别制备的Flag Tagbeads产品，使用该产品进行IP实验，在后续的IP-WB步骤中，可以完全避免抗体轻重链的条带出现。本产品可以识别带有Flagtag以及3× Flagtag的融合蛋白或者细胞裂解液。

Flag Tag序列：DYKDDDK。

1.收集细胞：

对于一个免疫共沉淀反应 ，推荐使用 10⁶-10⁷个表达Flag融合蛋白的哺乳动物细胞。服出培养液， 加lml预冷PBS于细胞中并刮下细胞，之后将细胞转入预冷管中。4℃，500g离心3分钟，弃上清液。用预冷PBS洗两遍细胞沉淀物。

2. 裂解细胞：

(1)用 500μl预冷的Lysis buffer（RIPA或者NP40） 重悬细胞．

注：在Lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂（推荐使用cocktail类型的蛋白酶抑制剂，货号A10004：200X 蛋白酶抑制剂复合物）

(2)将离心管放在冰上30分钟，每10分钟重悬一次细胞。（建议超声1-2次）

注：在这步细胞溶解物可放入-80℃保存。

3.平衡beads：涡旋anti-FlagAgarose，吸取25μ1anti-FlagAgarose至预冷500μ1Lysis buffer中， 3000rpm/1200g, 4℃离心2分钟，去掉上清，重复一次。

4.结合蛋自：

(1) 将裂解获得的细胞蛋白提取液加入平衡后的anti-FlagAgarose中（建议取50μ1上清液作为input对照用于兔疫印迹分析），在4℃环境中上下颠倒孵育3-4小时。

(2) 3000rpm/1200g, 4℃离心2分钟，去掉上清。

5.洗anti-Flag Agarose：重悬beads于500μl预冷的PBST溶解液中，1200g, 4℃离心2分钟，去掉上清，重复3次。

注：如果非特异结合比较多，可以在PBST中增加Nacl浓度到200-500mM。

6.洗脱结合蛋白：

(1)100μlSDS loading buffer重悬anti-FlagAgarose。

(2) 将Agarose在95℃中加热10分钟，使免疫复合物分离出来。3000rpm/1200g, 4℃离心2分钟， 取上清跑SDS-PAGE。

(3)如果后续IP产物需要进行质谱鉴定，可以使用以下方法来替代步骤（1）和（2）：加100-200μl 0.2M,PH2.5的甘氨酸-盐酸(含有0.2%的SDS)， 重悬Agarose，保持混匀状态孵育30s, 3000rpm/1200g, 4℃离心2分钟。将上清转移至新的离心管中，加入10-20μl lM PH10.4的Tris base中和。

储存于4°C，禁止冻存。保质期12个月。