本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验(ELISA)往预先包被有人25羟基维生素D(25-OH-VD)的微孔中 ，依次加入样本、标准品、HRP 标记的抗原 ， 中间经过 温育和洗涤 ，用底物 TMB 显色 ，TMB 在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成 蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠孕酮(PROG)呈负相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD 值），计算样品 浓度。

灵敏度：1.5ng/mL

检测范围：3.1-200ng/mL

1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须 在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.洗板不正确可能导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液

体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印 ，否则影响 OD 值。

4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色 ， 已经变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂

白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

8.不能使用过期产品 ，不同货号和批号组分不得混用。

9.试剂盒以外来源的重组蛋白可能会出现与本试剂盒抗体不匹配而不被识

别的情况。

10.如果可能传播疾病 ，所有的样品都应管理好 ，按照规定的程序处理样品

和检测装置。

1.酶标仪（ 450nm）

2.高精度加样器及枪头 ：0.5-10uL、5-50uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

1.血清 ：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4℃过夜, 然后 1000×g 离心 20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保 存,但应避免反复冻融。

2.血浆 ：用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的 30  分钟内于 2-8℃ 1000×g 离心 15 分钟,取上清即可检测,或将上清置于 -20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

3.组织匀浆 ：用预冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液（匀 浆中裂解的红细胞会影响测量结果）,称重后将组织剪碎。将剪碎的组 织与对应体积的 PBS（一般按 1:9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对 应 9mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐 在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为 了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最 后将匀浆液于 5000×g 离心 5~ 10 分钟,取上清检测。

4.细胞培养物上清：请 1000×g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将上清 置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

5.其它生物标本： 1000×g 离心 20 分钟,取上清即可检测。

6.样品外观 ：样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。

7.样品保存 ：样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于 4℃ ,  若不能及  时检测，请按一次使用量分装,冻存于-20℃（ 1 个月内检测），或-80℃

（6 个月内检测）,避免反复冻融,标本溶血会影响最后检测结果, 因 此溶血标本不宜进行此项检测。

1.请提前10分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.标准品梯度工作液配制：加入1mL通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀，然后根据检测范围进行浓度稀释。采用倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500μL通用稀释液,5000pg/mL的标准品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混匀配成标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体，具体如下图。

3.HRP-抗原工作液配制：使用前15分钟将浓缩HRP-抗原于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩HRP-抗原稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，当日使用。

4.1×洗涤液配制：取10ml20×洗涤液到190ml蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置)。

1.从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.加样：分别将样品或不同浓度标准品按照50μl每孔加入相应孔中，空白孔加入50μL通用稀释液，紧接着每孔加入50μLHRP-抗原工作液。盖上封板膜后37℃温育1小时。（建议：将待测样本用通用稀释液最低稀释1倍后再加入酶标板内测试，从而减少基质效应对测试结果的误差影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。

3.洗板：弃去液体，每孔加入300μL1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

4.加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。

5.加终止液：每孔加入终止液50μL，立即在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断：

1.计算标准品和样本复孔的平均 OD 值。 以浓度为横坐标 ，OD 值为纵坐 标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白 组的值)。

2.若样品 OD 值高于标准曲线上限 ，应适当稀释后重测并在计算样本浓度 时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考 ，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

注意 ：本图仅供参考 ，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。