First-Strand cDNA Synthesis Kit是基于Reverse Transcriptase从Total RNA或Poly(A)+RNA合成 第一链cDNA的试剂盒。Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H- ) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程 改造后获得的全新逆转录酶，相较而言Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。 Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度，适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，Reverse Transcriptase增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录，可合成长达12.3 kb的第一链cDNA。 First-Strand cDNA Synthesis Kit包含合成第一链cDNA所需的所有组分，并提供Random Primers和Oligo (dT)23VN 两种cDNA合成引物。可根据实验需要选择Random Primers、Oligo (dT)23VN或基因特异性引物作为逆转录引物， 合成的第一链cDNA产物可用于后续的PCR扩增、qPCR反应等实验。

将所有组分存放在-20℃并避光保存。尽可能避免反复冻融

1. RNA 变性：在 RNase-free 的 PCR 管中配制如下混合液；65°C 加热 5 min，反应结束迅速置于冰上冷却 2 min， 短暂离心。

*Note: RNA 变性步骤可选，RNA 变性有助于打开二级结构，提高逆转录效率；对长度超过 3 kb 的 cDNA 片段，请勿省略该步骤。

2. 按下表配制逆转录反应体系：

3. 轻轻混匀上述反应物，瞬时离心，按下表设置逆转录程序：

*Note:a. 如果使用的是 Random Primers，则需要设置此步骤；如果使用的是 Oligo (dT)23VN 或 Gene Specific Primers 则可省略此步骤。 b. Reverse Transcriptase 对具有复杂二级结构的 RNA 模板仍仍具有良好的扩增能力，因此通常建议在 42°C 进行反应。当使用特异 性下游引物进行逆转录时，可能会因错配而扩增出非特异性产物，此时可在 45-50°C 进行反应以便减少非特异性扩增。

4. 得到的逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可分装后于-20°C短期保存，-80°C长期保存，避免反 复冻融。

*Note: 如果使用合成的第一链 cDNA 为模板进行 PCR 反应，模板加入量会对 PCR 的扩增效率有影响，其加入量为 PCR 反应液量的 1/10 以 下；在 RT-PCR 反应中，如果有非特异性扩增或无扩增产物时，可将第一链 cDNA 合成反应液用 RNase H 处理（如加入 1 μl RNase H 到合成反应液 37°C 孵育 20 min）。

1. 如果模板来源于真核生物，建议选择 Oligo (dT)23VN，该引物可与真核生物 mRNA 的 3’ Poly(A)尾配对，获得最高 产量的全长 cDNA；如果模板来源于原核生物，建议选择 Random Primers 或 Gene Specific Primers。

2.当后续实验为 qPCR 时，可以将 Oligo (dT)23VN 与 Random Primers 1:1 混合使用，可提高 qPCR 结果的真实性和重 复性。

3. Random Primers 特异性最低、适用性较广，mRNA、rRNA、tRNA 和 LncRNA 等模板均可用 Random Primers 进行 逆转录。一般 2 kb 以下的 cDNA 合成时 Random Primers 的使用量为 1-2 μl；2 kb 以上的 cDNA 合成时 Random Primers 的使用量为 0.4-1 μl。

4.当模板具有复杂二级结构或 GC 含量较高时，使用 Oligo (dT)23VN 或 Gene Specific Primers 无法有效引导 cDNA 合 成时，可使用 Random Primers 为引物。 / 3 / www.apexbt.com 5. Gene Specific Primers 特异性最高。但有些情况下 Gene Specific Primers 无法有效引导第一链 cDNA 合成。可改用 Oligo (dT)23VN 或 Random Primers 重新进行逆转录。

1. 实验在冰上操作，过程中避免 RNase 污染。

2. RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，RNA 提取过程应注意防止 RNA 降解。