中文名：豆科植物截型苜蓿以及它的内生固氮菌的蛋白质组

英文名：A proteomic atlas of the legume Medicago truncatula and its nitrogen-fixing endosymbiont Sinorhizobium meliloti

发表单位：美国威斯康星大学麦迪逊分校

杂志：nature biotechnology，2016

影响因子：43.11

文献摘要：

豆科植物作为农业系统中非常必要的一部分，可以富集土壤中的氮，对环境中的化肥需要量很少，这主要得益于豆科植物与根瘤中的固氮菌的共生关系，固氮菌可以固定空气中的氮并转到寄主体内，本研究绘制了截型苜蓿及其内生中华根瘤菌的定量蛋白图谱，其中包括了23000多个蛋白，20000个磷酸化位点以及700个赖氨酸乙酰化位点。本研究对调控共生的机制进行了讨论，鉴定了一个关键的调控因子钙结合蛋白，这个蛋白在共生体中调控基因表达。

研究背景:

为了满足全世界对食物的需求，目前植物中的研究主要育种目标是提升产量，营养成分的含量及对病原菌的抗性等。豆科植物的特别之处就在于可以获取空气中的氮元素通过固氮菌的固氮作用，以此减少对化肥的需求。豆科植物的根瘤是非常特别的器官，可以将自由存在的根瘤菌分化为可以表达固氮酶的类细菌属。但是调控此过程的分子机制并不清楚，对此机制的探究对非固氮作物如玉米，水稻及小麦等研究具有一定的指导作用。

最近针对于寄生模型截型苜蓿及的大规模的转录组分析找到了组织特异性表达的基因，尤其是在种子及瘤发育的过程中特异表达。最新的截型苜蓿的基因测序的报道完善了基因的注释信息。本研究利用这些资源，结合质谱技术，绘制截型苜蓿及其共生固氮根瘤菌的定量蛋白质图谱，共找到23013蛋白（其中19679个来自宿主苜蓿，3334个来自根瘤菌），并发现了20120个磷酸化位点以及734个赖氨酸乙酰化位点。通过这些结果鉴定了核心的苜蓿蛋白组以及组织特异性表达的蛋白簇。并对新的蛋白进行功能的推断，最终，构建了共生相关的调控网络。

研究结果:

1.  截型苜蓿及其共生根瘤固氮菌的蛋白及转录后修饰组：本研究收集了苜蓿的七个主要的器官：花，芽，叶，茎，根，种子及根瘤，并且对根瘤的三个不同发育时期（根瘤菌接种后10天幼嫩期，14天成熟期，28天老化期）的材料均进行了定量蛋白组研究。采用的方法是HPLC-MS/MS，接下来与所有已知的数据库进行比对，苜蓿的19769个蛋白中，15813个是已经的基因，324个之前没有被注释过。磷酸化及乙酰化是重要的翻译后修饰方式，本研究利用IMAC（固化金属离子亲和色谱法）找到了20120个磷酸化位点及734个赖氨酸乙酰化位点，其中324个未知的苜蓿蛋白中含有175个磷酸化位点及5个乙酰化位点。并进行了label-free及TMT法进行蛋白定量研究。

图1：苜蓿的蛋白图谱圈图，分别代表不同的器官及根瘤菌接种后不同时期的根瘤组织，从外到里分别代表相对蛋白表达丰度，组织特异性表达的蛋白，组织特异性磷酸化位点及组织特异性乙酰化位点。

2. 全面的蛋白表达分析：构建蛋白表达圈图， 每一个组织表达超过9000个蛋白，所有组织共有的蛋白有5701个，这部分称为核心蛋白组，其中的蛋白成员表达量都较高并且不同器官中表达量相似。事实上，核心蛋白组检测的数量占到表达数量的一半，但表达量却占到80.3%。通过图1可以看出，花，根和种子器官特异性表达的蛋白最多，在花和根中特异表达的蛋白主要与细胞壁代谢，植物发育及病原菌抗性有关；种子中特异表达的蛋白主要与营养和脂类储存相关。

3. 核心蛋白组的转录后修饰：PTM（翻译后修饰）对蛋白功能进行了调控，在核心的蛋白组中，同样存在着组织特异性的PTM修饰。这些修饰针对于相同的核心蛋白组对了满足不同组织的需要进行了相应的修饰，例如在根瘤中，菌类依赖寄主提供有机酸，主要是苹果酸，对于固氮过程中ATP的产生是必要的，在核心蛋白组中，作者发现根瘤接种成熟的过程中苹果酸脱氢酶磷酸化作用在增强，说过其调控作用。PTM修饰在原核生物中的研究并没有在真核生物中的研究普遍，作者同时观察了在固氮过程中根瘤菌的蛋白的PTM情况，发现F6BZI0，nifH,nifB,F6BZI1,fixT等蛋白发生了磷酸化及乙酰化，还需要进一步的试验去探究发生修饰的时间，这些修饰在固氮的生物过程中的生物学功能。

4. 截型苜蓿蛋白组的功能注释：为了提供基础的蛋白及修饰信息，本部分进行了方差分析，聚类分析及基因的GO富集，根据这些结果，进行了蛋白共表达分析，PTM共调控分析及序列比对，来进行功能注释及预测基因产物。这种方法将已知蛋白与未知的PTM修饰进行了结合，在一些结果中，作者发现蛋白与PTM发挥的作用是一致的，例如为了使根瘤菌固氮酶发挥活性，根瘤通过表达豆血红蛋白来调节氧的水平，血红蛋白Lb120-1基因家族呈现了相似的蛋白表达模式，同时多个磷酸化位点也表现了相同的趋势（图2）。

图2：蛋白表达，磷酸化修饰及乙酰化修饰的聚类图，分成了12组，例如其中蛋白2及磷酸化12有着相似的趋势并行使着相似的功能。

5.  蛋白的动态分析揭示根瘤特异的网络：通过根瘤不同发育时间的蛋白组学研究，与根组织作比对鉴定了一系列显著调控此过程的蛋白及磷酸化事件。这些蛋白发现与根瘤的行使功能相关比如结瘤素，根瘤老化，运输氧及免疫应答等功能。其中一个显著上调的膜联蛋白D8,是丝苏氨酸激酶，可能在根瘤的生长发育中起到关键的作用（图3），展示了利用转录组数据及蛋白数据进行蛋白表达及PTM修饰的对比根瘤与根的差异，可以发现一些显著上调及下调的蛋白及功能。通过结合转录组数据构建共表达网络，发现了关键的钙结合蛋白是一个关键的调节因子（图3）。

图3：根瘤特异性蛋白及修饰，左侧的两个火山图分别展示了与根相比，显著上调及下调的蛋白及磷酸化的同源异构体，右侧图展示了利用转录组数据和蛋白数据构建的共表达网络，其中不同色代表不同的差异倍数。

小结

Ø  本文领先的研究亮点是通过质谱技术手段鉴定得到23000多个蛋白，20000个磷酸化位点以及700个赖氨酸乙酰化位点。质谱技术针对复杂的蛋白样本，例如植物根、茎、叶等器官的全蛋白提取物，很难能够鉴定得到那些表达量相对较低的蛋白质。大部分研究拟南芥的蛋白组文章中鉴定到的蛋白数量在6000-10000个，磷酸化修饰位点在5000-10000个。所以该研究组能够鉴定这么大规模的蛋白种类和修饰位点是具有很大的技术难度和挑战的，一般的实验室很难得到同样的实验数据。

Ø  本文的遗憾之处在于通过质谱鉴定得到的表达差异蛋白仅仅通过生物信息分析得到可能存在的蛋白调控网络，并没有进一步深入验证这些蛋白内源水平调控网络以及对于蛋白功能的深入研究，从而导致在调控机制方面的研究不够深入。

Ø  抗体组技术与质谱技术在该类型的研究中正好是一对互补的技术手段：通过大规模、高通量的抗体组芯片筛选，同样可以得到蛋白共表达网络，同时利用已开发的抗体可以快速、方便的进行内源蛋白互作网络的实验验证，以及针对蛋白的修饰变化、定位变化、剪切变化进行深入的功能研究。

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