中文标题：山杨木：通过空间高分辨率转录组图谱显示欧洲山杨树的非特殊模块化木材形成过程

英文标题：AspWood: High-spatial-resolution transcriptome profiles reveal uncharacterized modularity of wood formation in Populus tremula

发表单位：瑞典优密欧大学

发表杂志：Plant Cell 2017（IF: 8.688）Published on June 27, 2017, doi:10.1105/tpc.17.00153

解读人：岳欣

文章摘要：

树木象征着陆地上领先的碳储备资源和可再生的木质纤维素来源。目前，对大量未被驯化的物种，还有很大的产量和质量提升空间，对于形成层增长以及木材形成的转录组调控网络的进一步研究有利于培育优良物种。作者研究的高空间分辨率RNA测序囊括了欧洲山杨的次生韧皮部、维管形成层以及木材组织形成过程。该转录组包括28294个带注释的基因，78个新的蛋白编码基因和567个长链非编码RNAs。除了那些在二次细胞壁沉积过程中高表达的基因，大多数来源于杨柳科基因组的旁系同源物，均已经明确分化表达。共表达网络分析表明调控形成层增长以及木材形成的转录组分析包含了大量的模块，这些模块拼接起来组成了一个统一的组织发育过程。作者的高空间分辨率数据可以证明新的特殊基因在木聚糖和纤维素生物合成中的新功能，以及揭示了木质部导管、纤维分化和木质化过程的部分调控基因的功能。

研究背景：

高空间分辨率转录组测序新方法简介：

近日，国际学术期刊Nature Protocols在线发表了中国科学院上海生命科学研究院景乃禾研究组的最新研究成果Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue sampleswith Geo-seq。该研究工作建立了一种可以获得具有空间位置信息的少量细胞转录组图谱的技术方法。近年来，单细胞测序技术迅速发展，使得研究细胞之间的异质性成为可能。然而，目前单细胞测序的方法均会丢失细胞在体内原有的位置信息，而对某些研究领域如发育生物学、肿瘤生物学而言，细胞来源的位置信息十分关键。该研究团队通过整合与优化单细胞测序和激光显微切割技术，构建了一种能够获得少量细胞转录组信息、同时保留细胞原有位置信息的测序方法：Geo-seq。

Geo-seq是一种高效、高分辨率的空间转录组分析方案，既可用于转录图谱的三维重建，也可用于研究具有特殊结构的少量组织或细胞的转录组信息。利用Geo-seq技术，景乃禾课题组绘制了小鼠早期胚胎原肠运动中期精细的三维分子图谱，并揭示了小鼠细胞谱系蓝图建立过程中的空间转录组特征、转录因子和信号通路调控网络，相关工作发表在2016年的Developmental Cell杂志上。Geo-seq技术也逐渐应用于人类疾病与动植物育种抗病相关的研究中。

木材形成生物学过程：

木材是多年生木本植物维管形成层分化产生的次生木质部不断沉积、累加的结果。维管形成层在结构上被称为侧生分生组织。侧生分生组织的外部细胞（树皮方向）分裂形成韧皮部，从而通过韧皮部将光合作用产物输送至接收的组织，侧生分生组织向内分裂形成木质部，即木材；同时侧生分生组织为茎干提供机械支持作用，使水分和矿物质营养从根部系统向上运输。木材形成是一个高度组织有序的过程，主要包括以下发育步骤：细胞分裂、细胞增大、细胞壁增厚、木质化和细胞程序性死亡过程。

维管形成层分化的阶段首先在生长期植株的茎中解剖发现，茎尖连接叶原基的区域形成原形成层束。在近顶端伸长区，原形成层的最内层细胞分化形成原生木质部元件，并进一步沿着茎干在更多轴心排列的细胞中形成后生木质部；相对应地，原生韧皮部和后生韧皮部从原形成层最外层的离心部分发育形成。后生木质部和后生韧皮部之间还有一层未分化的原形成层细胞。这些细胞组成维管束形成层，通过平周分裂生成次生木质部和次生韧皮部。维管束中分布的薄壁细胞脱分化形成连接单个维管束形成层的束间形成层。最终，从树木的顶端到根部在木质部和韧皮部之间形成连续的圆环，称为维管形成层。维管形成层细胞平周分裂增加树干的直径，同时在木质部和韧皮部中形成次生生长。在树干增粗的同时，形成层通过垂周分裂增加圆环的周长，从而进行高生长。这一系列的事件在木本植物的茎生长中从顶端到基部连续进行，在空间上有组织的发生。因此，次生分生组织的发育和分化在树木的生长和发育过程中起着关键的作用。部分形成层原始细胞一直存在于分生组织中，始终保持不断分裂、持续增殖的特性。其两侧的细胞分裂分别形成木质部母细胞和韧皮部母细胞。这些原始细胞通过垂周分裂调节射线细胞的数量以及建立侵入生长的方向，从而共同决定分生组织的结构模式。尽管形成层在细胞分裂、建立模式等主要功能上与其它分生组织相似，但是它们又有许多独特的面。与顶端分生组织不同，形成层是一个复杂的组织，主要含有两类形态迥异的细胞类型：轴向长的纺锤形成层细胞（FCC）和圆的射线形成层细胞（RCC），因为 FCC和 RCC 通常可以互相转换。这也与初步阐明的植物干细胞特性一致。因此，将形成层细胞视为干细胞已逐渐为学术界所认识和接受。干细胞活性通常被认为是生长速率的重要决定因子。形成层干细胞对木材生产效率具有重要作用，主要体现在两个方面：⑴木质部母细胞的数量，取决于原始干细胞形成木质部母细胞还是韧皮部母细胞以及木质部母细胞离开分生组织区域的速度；⑵木质部母细胞的细胞周期的长短。

木质化首先发生在含有次生壁的导管分子和相连射线细胞中，而后在纤维和孤立的细胞中进行。当S1层沉积完成后，木质素首先在细胞中层，特别是细胞角隅出现。S2层形成过程中，木质化继续向内发生，伴随着纤维素、甘露聚糖和木聚糖的沉积。当S3层形成时，木质素沉积最多，直至所有细胞壁都木质化为止。木质素是异源酚类多聚物，具有重要的生理功能。木质素填充于纤维素构架中赋予了细胞壁坚硬的结构特征，增加了植物体的刚性；其疏水性使植物细胞壁具有不透水性，保证了植物体内的长距离运输；同时，木质素亦加强了植物对生物与非生物逆境的防御能力。木质素主要由３种单体：香豆醇、松柏醇和芥子醇。它们分别聚合成3种不同的木质素：对－羟基苯基木质素（p-hydroxyphenyl lignin，Ｈ木质素），愈创木基木质素（guaiacyl lignin，Ｇ木质素）和紫丁香木基木质素（syringyl alcohol，Ｓ木质素）；裸子植物针叶树主要含G木质素，是紧缩型的木材结构，而被子植物阔叶树则含有G和S木质素，是松散型木材。

转录组学和基因分析已被用来揭示作为模型系统生物的拟南芥次生生长的分子机制。本研究利用切线从木材的不同发展阶段获得转录组信息。随后，使用微阵列进行了一些类似的研究，实现更高的基因覆盖程度。然而，早期的转录组研究形成层生长的木材的形成仅限于特定的木质组织。空间定位的RNA测序方法可使转录组分析具有比以前更高的动态范围。而且，RNA序列不需要事先了解基因模型，可以直接有效地识别所有的基因。

关键成果：

一、山杨木：关于次生生长的空间高分辨率的基因表达谱绘制

作者利用高空间分辨率技术测定发育韧皮部和木质组织的基因表达谱，具体是通过对野生白杨基因型（P. tremula）进行RNA测序产生。作者将切片（每15μm厚）分成25到28个样品，从切片中获得截面的解剖检查结果。作者参考了P.毛果杨基因组信息，并将测定结果进行分类，获得28294种注释基因。此外，作者确定了新的蛋白编码基因，通过推测而获得了部分长链非编码RNAs（lincRNAs）。在这些数据中发现了部分在毛果杨中没有注释的新表达位点，也确认了大部分在P.毛果杨中已经阐明的基因表达情况。作者通过分析指出新的转录重编程事件作为新的参考点，与树种资源显示所有的表达谱对应起来。作者进一步使用层次聚类将基因分组，划分转录组。分成八个具有相似表达区的主要基因表达簇。这八个星团更进一步细分为16个子集群，其中除四个子集群外其他子集群中均有明显的平均表达谱。此部分结果将木质部转录相关的基因群根据测定的结果重新定位和区分。

此部分取材是本文的亮点，上图A黄色竖线是表示其取样组织层，每层15μm。不同细胞的活力是用NBT (nitroblue tetrazolium)染色确定的，组织纵向切片是用冷冻切片机。好处在于尽量单一组织取样，可以测到更多特异表达基因。

通过比较清晰明了的聚类分析可知，此部分结果将木质部转录相关的基因群根据测定的结果重新定位和区分。分析结果较为干净与明显。

二、共表达网络分析揭示了转录模块的连续性在形成层生长与木材形成的作用

为了识别潜在的新的次级生长调节控制情况，作者通过模块分析构建了一个共表达网络。该网络连接的基因具有高度的共显性表达情况，其中囊括了29246个表达基因中的14199个。然后紧接着确定基因共表达网络的核心。值得注意的是，初步判定几个确定的共表达网络编码蛋白和lincRNA基因的高度集中情况，表明他们可能在形成层生长与木材形成的过程中发挥重要功能。（通过共表达网络挖掘到了具有重要功能的基因）然而，与先前注释的基因相比，更高比例的新基因没有被整合到网络中（30%～50%），这可能反映了它们的进化到最近起源（即低保守性），反映了对它们表达的较弱的遗传控制。这些基因代表潜在的物种或分支特定的适应和调控机制。（同时对新发现基因功能进行判断）

三、功能酶（酚氧化酶）的挖掘、功能确证（本文功能举例）

许多木质素单体基因的表达缺失可能表明这些参与酚类化合物比其他木质素的生物合成。大约一半的生物合成基因的表达具有双相联性的表达趋势。通过转录水平的分析，165个基因编码的酚氧化酶已确定。无论是过氧化物酶和漆酶已被证明在木材形成的组织，能够在体外聚合单甲氧基化（愈创木基G）和双甲氧基化（紫丁香的）单体为木质素类似物。作者发现，大多数功能酶表达量最高发生在次生细胞壁形成过程的同一阶段，也有一些具有较低的表达峰值在分化的韧皮部也出现的类似的相关性。作者的数据证实，这些酚氧化酶的基因表达主要与木质部成熟程度呈正相关。

文章核心思路：

文章重点剖析：

Ø  研究问题：树木形成层生长和木材形成的调控机制挖掘，依靠手段：空间高分辨率基因表达分析；

Ø  测试与取材方法：在生长季的中间（最旺盛时期），采用冷冻切片取材的方式，突出了单一细胞的组织形态和RNA定位信息，完整性；每株树取25-28分组织层，每层厚度为15μm，共测106个转录组。

Ø  文章的意义与用途：一方面对空间高分辨率转录组的测定手段进行了宣传，另一方面，对组学数据如何分析提供了借鉴；最后，提供了有用的数据库http://aspwood.popgenie.org。

与抗体组结合的启示

1、本文领先的特色是使用空间高分辨率RNA测定方式对转录组学数据进行直观的比较，并且获得了保守的基因调控模块，相比传统的转录组测定方式而言，RNA空间高分辨率测序方法的可用性使转录组分析具有比以前更高的动态范围与定位效应。这部分结果的获取源于采用组织冷冻切片的方法同样可以运用到蛋白提取与定位，我们可以结合抗体的定位效应能够更加完善的揭示动态信息来向客户宣传；从文章发表角度出发，可以向客户说明：源于取材的精细化和后期较好的聚类分析可以把文章发表到PC级别，但是这样的成功不可复制，不能照搬思路应用到其他树种的研究，创新性已经明显不够，然而从抗体组作为研究蛋白层面的高新技术角度，从不同维度进行更高水平的研究，文章的档次是只增不减的；

2、空间高分辨的研究手段在蛋白层面的提示：MALDI-TOF-MS技术可以用于组织显影与空间定位等，对于空间定位的思路，抗体组具备时空定位效应，可以捕捉蛋白动态信息，这是抗体组的巨大优势；

3、尽管目前在RNA测定方式上面将转录组水平研究发挥到极致，但其自身的限制不可避免也不可忽略，由于mRNA与蛋白的表达之间并非呈现出一一对应的关系，而生物性状的直接效应因子是蛋白而非RNA，因此研究蛋白层表达更具有直接优势。抗体组利用大规模、高通量的抗体组芯片筛选，能够准确地获得蛋白表达信息，再通过加权蛋白共表达网络分析，为物种性状判断优势、育种优势，品种质量监控等各方面的问题提供最直接的网络解析，同时对于已经开发的抗体还可以进行快速、方便的进行内源蛋白Western Blot验证、组织定位、蛋白互作以及修饰变化等功能研究，抗体本身就具有时空定位效果，能够较大程度利用自身特异性捕获蛋白的各项行为，预示着我们正在做的就是不断开发与实践蛋白水平的高动态、高通量的分析。另外一方面，可以同时与空间高分辨率的RNA测定方式联用获取基因-蛋白-性状相互关联的重要生物信息资源整合。此篇文章的核心思路与抗体组技术应用有一定程度的相似性，这也为蛋白组学的前沿研究手段—抗体组提供了可以参考和借鉴的范本，利用此文章最终阐释的功能与应用，我们完全可以采用抗体组对蛋白的研究方法实现，而且能够在准确性和研究的可持续性上面表现出不可超越的优势。