该产品为一款核蛋白提取试剂盒，快速且可重复，基于温度依赖的相分离，制备高度富集核蛋白提取样品。

同时试剂盒中含有配套的核蛋白内参抗体（P30266，Histone H3.1 Rabbit pAb）。

1. 细胞准备

常规动物培养细胞在本流程下核蛋白得率约为：2-4mg/1x10⁸细胞，建议操作细胞量gt;1x10⁷细胞。细胞可在贴壁培养或悬浮培养下至活性浓度，一般为接近但未达饱和密度，例如80%满的贴壁密度，悬浮细胞约在1-2x10⁶/ml。过高的培养密度会导致死细胞增多，在蛋白提取过程中引入更多的碎片污染，例如DNA纤维沉淀。悬浮培养细胞在提取前离心去上清，1xPBS洗2

遍去除培养基后重悬于1xPBS并计数备用，计数时需要使用肽酚蓝检测活细胞比例gt;90%。贴壁细胞使用胰酶或其它解离方法解离为单细胞悬液，一般推荐1xPBS含1mM EDTA 37°C处理10 min以上（不同细胞处理时间有差异）以减小对核蛋白组的影响，细胞悬液以与悬浮培养细胞的方式洗涤与重悬计数备用。

2. 溶液准备

2.1 自备溶液：1x PBS，500mM EDTA（与1xPBS 1:500稀释制备细胞解离液用）

2.2 胞浆蛋白释放缓冲液A【适用大多数培养细胞，部分细胞系对缓冲液A较为敏感，在缓冲液A处理下会释放较多的DNA污染，表现为在缓冲液A处理下，溶液中会出现较多絮状DNA沉淀，导致包裹为细胞团，影响提取效率与产生污染，出现这种情况时使用胞浆蛋白释放缓冲液B】；

2.3 胞浆蛋白释放缓冲液B（A液备选）；

2.4 缓冲液C；

2.5 缓冲液D；

2.6 缓冲液E（D液备选）

2.5 蛋白酶抑制剂（货号：A10004，200×，需额外购买，或者使用其他蛋白酶抑制剂）

3. 核蛋白提取流程

3.1 预先在需要使用到的缓冲液A/B，缓冲液C，缓冲液D/E中加入蛋白酶抑制剂混匀，各缓冲液4°C保存。

3.2 1x PBS重悬并计数好的细胞 1000 g离心5 min，弃上清。

3.3 立即按 2ml/ 1x10⁷ 细胞比例加入胞浆蛋白释放缓冲液A或B，充分混匀，在4°C冰浴下摇床温和混匀10 min。细胞系首次实验可先使用缓冲液A液，如果在A液中出现显著絮状DNA释放，则需要更改为缓冲液B液。缓冲液A的加样比例根据细胞大小可作调整，一些血液来源细胞系细胞体积较小，与常规贴壁细胞系有明显差异，缓冲液A量可根据细胞体积差异与离心后的沉淀体积调整，例如人B细胞与T细胞来源细胞系，细胞体积可为常规贴壁细胞的1/10以下，缓冲液A可用到2ml/1x10⁸细胞。

3.4 14,000 rpm 4°C离心10 min，收集上清为胞浆蛋白提取液，沉淀按 0.2 ml/1x10⁷细胞比例加缓冲液C，吹打混匀后，4°C摇床温和混匀30 min。

3.5 14,000 rpm 4°C离心10 min，保留沉淀。

3.6 按0.2 ml/1x10⁷细胞比例加入缓冲液D，吹打混匀。核蛋白提取需要辅助以超声裂解以打断DNA长链，建议低功率冰浴超声（例如20%以下），5 s/次，间隔10 s，超声10次。超声后在摇床冰浴温和混合30 min后，14,000 rpm 4°C离心10min，收集上清为胞核蛋白提取液。

3.7 部分DNA结合牢固的蛋白，需要使用含变性剂缓冲液处理提高提取得率，如果不需要提取蛋白的天然构象活性，核蛋白提取时可使用缓冲液E，同上，超声后，4°C条件下，摇床温和混匀1hr或过夜以达充分变性提取目的，之后以14,000 rpm 4°C离心10 min，收集上清为胞核蛋白提取液。

3.8 上述收集的各蛋白组分进行蛋白定量，推荐氨基黑法，或稀释5倍以上用Bradford法测定。也可以使用BCA定量，但是准确度不高，只能用来调平上样量。

3.9 核蛋白富集质检：各蛋白提取上清组分，制备为SDS蛋白裂解液，推荐蛋白浓度1 mg/ml以上，用于后续WB分析。WB分析时，使用试剂盒所带的膜蛋白内参抗体作为内参。（同时建议带上GAPDH作为对照内参，判断胞浆蛋白残留情况，参考结果见下图）

P30266 Histone H3.1 Antibody信息

Description：Core component of nucleosome. Nucleosomes wrap and compact DNA into chromatin, limiting DNA accessibility to the cellular machineries which require DNA as a template. Histones thereby play a central role in transcription regulation, DNA repair, DNA replication and chromosomal stability.

UniProt：P68431

Mol Weight：17kDa

Isotype：Rabbit IgG

Reactivity：Human,Mouse, Rat, Pig, Bovine, Sheep, Dog, chicken

Application：WB 1:5000~1:10000 IHC 1:50~1:100 ICC/IF 1:50~1:200