ELISA试剂盒采用“夹心法”:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的靶蛋白，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合，SABC复合物与生物素化检测抗体结合，形成免疫复合物，加入TMB显色液后，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加入终止液变黄色，检测过程中未结合的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，靶蛋白浓度与OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度，从而对检测样品进行定性或相对定量分析。

1、标准规格酶标仪、自动洗板机、恒温箱。

2、移液器及吸头，0.5-10μL,2-20μL,20-200μL,200-1000μL。一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。

3、干净的试管和EP管。

4、双蒸水或去离子水。

●血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），收集上清-20℃或者-80℃冷冻保存。

●血浆：应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，抗凝血离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，-20℃或者-80℃冷冻保存。

●尿液、胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，-20℃或者-80℃冷冻保存。

●细胞培养上清：用于检测分泌性的成分，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，检测细胞内的成分时，用PBS稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过超声破碎或反复冻融(利用液氮和37℃水浴对样品进行两到三次快速的冻融)，以使细胞破坏并放出细胞内成份，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清（如需要可取部分进行BCA蛋白定量），-20℃或者-80℃冷冻保存。

●组织标本：切割标本后，准确称取组织重量。按重量(g):体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集匀浆上清（如需要可取部分进行BCA蛋白定量），-20℃或者-80℃冷冻保存。

1、每个标本量收集体积＝约60μl×检测指标，如要做复孔，标本量收集体积＝约60μl×检测指标×2，更多复孔以此类推。

2、收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定，以确定样本保存温度，保存条件参考样本保存。

3、血清标本采集时，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

4、为了保证尿液检测结果的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，盛尿容器要清洁干燥。最好使用一次性的容器（如塑料尿杯），避免因用药并清洗不干净而造成的污染，影响检测结果，尿液标本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存，以免细菌繁殖，因在室温（尤其是夏季）中久置后尿中的磷酸盐等可析出结晶而干扰检测。

5、冻结标本融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分轻缓混匀，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。

6、混浊或有沉淀的标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。也可加入适当防腐剂。

8、激素类标本需添加抑肽酶。

1、在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测，每次检测都应做标准曲线。

2、洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高，从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

3、检测时所有试剂都要恢复到室温，板条开封后剩余板条需封好，放回袋中1个月内用完。

4、试剂盒使用超敏TMB溶液，显色过深时会出现沉淀状，属正常现象，混匀即可，不影响结果判读。

5、试验中请穿着实验服并戴乳胶手套做好防护工作。

6、不同批号的试剂盒组份不能混用(反应终止液除外)。

7、试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用。

1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，读数前15分钟打开酶标仪预热。

2、洗涤液配置：用蒸馏水1:30稀释（例：1ml浓缩洗涤液加入29ml的蒸馏水）。

3、标准品配制：取8个1、5ml离心管，分别标注S1,S2,S3,S4,S5,S6，S7,Blank,第一管S1中加入标准品/样品稀释液900μl，S2至Blank中分别加入标准品/样品稀释液200μl，在第一管S1中加入标准品S（10×）溶液100μl置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200μl，移至S2，如此反复作对倍稀释至S7,混匀，Blank为空白对照。（标准品的用量也可根据自己需要配置）

4、生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。

5、SABC复合物工作液配置:使用前20分钟，用SABC复合物稀释液将100×浓缩SABC复合物稀释成1×工作液，当日使用，剩余弃之。

7、TMB显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液A液和B液1：1混合，避光放置备用。

8、如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。

9、当标准品/样品稀释液及洗涤液不够用时，可以用1*PBST替代。

1、加样：空白孔加入50μl标准品/样品稀释液，其余孔各对应加入标准品或待测样品50μl，贴上封板胶纸，将反应板混匀后置37℃，50分钟。

2、洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次，每孔加入1×洗液300μl，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。

3、加抗体：空白孔加入100μl生物素化抗体稀释液，其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100μl，贴上封板胶纸，混匀后置37℃，50分钟。

4、洗板：同上。

5、加SABC：每孔加入SABC复合物工作液100μl，贴上封板胶纸，混匀后置37℃，30分钟。

6、洗板：同上。

7、加显色液：每孔加入提前配置好的TMB混合液100μl，混匀后贴上封板胶纸，置于37℃暗处反应10-20分钟（具体显色时间根据显色结果而定）。

8、加终止液：每孔加入50μl终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

1、灵敏度:可测浓度小于25pg/ml。

2、重复性：板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%；

3、贮藏：2-8°C，避光防潮保存；

4、有效期：6个月。

1、所有OD值建议减除空白孔值后再进行计算，如空白孔OD低于0.1，也可以直接计算。

2、以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品OD值计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。

1、本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

2、若所检样本不包含在说明书所列样本之中，建议进行预实验验证其有效性，并注意留存样本。

3、使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。

4、试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责；