如何拍出一张美人如玉剑如虹的免疫荧光细胞图
发布时间:2016-05-31         浏览人次:         发布人:Dr. Bing abmart

当我还是一个无忧无虑头发茂密的硕士,我唯一拥有的相机是一个卡片机,而单身生物狗的身份基本断绝了我像陈老师一样不靠器材就能在摄影界大放异彩的可能性。看着同寝室的鸟学硕士拿着800mm大炮去研究湿地的鸟,昆虫硕士拿着百微环闪去拍臭虫的交尾,羡慕莫名。直到我去英国成为了Ph.D。很多年后,当面对拍鸟的大炮时,我依然回想起我Ph.D第一周时,埃及胖子默罕默德∙S∙艾莫带我去看DeltaVision荧光显微镜的那个遥远的下午。所有摄影器材在它的面前都显得那么Simple,那么Naive。一个不用全幅不用大三元不用妹子也能拍出牛逼照片的方法向我打开了大门。Exciting!

从那天起,我开始潜心研究怎么把一个细胞的胴体拍的美丽动人。首先是颜色越鲜艳越好,这个很好理解,你见过哪个妹子自拍把自己拍成马格南黑白风格?想要颜色鲜艳,就涉及一个怎么把很多细胞内的结构都标记上不同荧光的问题。共聚焦显微镜最多可以拍八个通道,可连续改变激发波长的显微镜能拍的通道更多。想看有多少种荧光染料,染料激发波长分别是多少的小伙伴请参见附录一。

怎么把这些染料标记到不同的细胞成分上让照片恶俗的鲜艳起来呢?基本手段就是用抗体做荧光免疫组化。有人说现在抗体特异性太差,能做IF的太少,这简单,找Abmart合成啊,保证除了设计的抗原我们的抗体谁也不认。还有人说,一抗来源基本只有鼠羊兔,那只能染三种啊。这就有几种解决方法,第一种,蛋白整合上荧光标记小肽,比如蛋白一端加个GFP tag, 这样可以多加几种颜色。第二种,如果你感兴趣好几种膜蛋白加好几种胞内蛋白,你可以不通透细胞膜,先把膜蛋白用IF标记荧光,然后通透细胞膜再做一遍IF。这样你就可以通过二抗的不同来区分不同的蛋白。除了用荧光抗体标记蛋白,很多染料可以直接标记细胞组分,比如DAPI可以染DNA,Fluo-4可以染钙离子等等。很多细胞器如溶酶体和线粒体都可以被一些特异性的染料标记。

选好了荧光标记,就开始做荧光免疫实验了。关于Protocol,每个实验室都有自己祖传的。我就提几点有可能影响最终照片质量的。第一点,固定的时候传统的4%的多聚甲醛自身具有一定的膜通透效果,使用的时候要注意。不想通透细胞膜的话使用2%的多聚甲醛。第二点,抗淬灭封片液我用过各方面最好的是Prolong gold antifade reagent。封完片子,那注射器针头压一下盖玻片,把气泡赶出来,不然影响拍照效果。

最后是选择显微镜的问题了,基本上所有国内学生都用Confocal,共聚焦显微镜。它对组织切片拍照的能力非常强大,对纵深的识别很好。但是对于单细胞,它的成像效果比不上DeltaVision。DeltaVision还有一个特长就是Live-cell imaging效果非常好。这两年大量超级分辨率的显微镜被推上市场,SIM,STED,STORM等等,它们的分辨率从共聚焦的微米级提升到了最小20纳米。我自己用过STED,效果确实好。但对一抗质量和抗原丰度的要求非常高。针对显微镜如果有人感兴趣,下回我们就把显微镜单独拿出来谈谈。

那么现在你片子拍出来了,后期你要不要做?怎么做?肯定是要做后期的,不然很多低丰度蛋白根本看不见。生物图像处理上PS并不是一个常用工具,当然美图秀秀也不是,美颜相机就更不是了。学界基本使用ImageJ来调对比度,亮度,图层合成等等。ImageJ我们也可以拿出来单独讲一下。

总之,到现在你已经有了很漂亮的图片了,就算和你的实验假说八杆子打不着,还是会有无节操杂志就因为你的图拍的好看就录用你文章的。

今天讲堂到此结束,附上荧光染料波长。最后有美照赏析。

Table 1

Sample Fluorescent Dyes

Excitation

Emission

Indo-1, Ca saturated

331 nm

404 nm

Indo-1 Ca2+

346 nm

404 nm

Cascade Blue BSA pH 7.0

401 nm

419 nm

Cascade Blue

398 nm

420 nm

LysoTracker Blue

373 nm

421 nm

Alexa 405

401 nm

421 nm

LysoSensor Blue pH 5.0

374 nm

424 nm

LysoSensor Blue

374 nm

424 nm

DyLight 405

399 nm

434 nm

DyLight 350

332 nm

435 nm

BFP (Blue Fluorescent Protein)

380 nm

439 nm

Alexa 350

343 nm

441 nm

7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0

346 nm

442 nm

Amino Coumarin

345 nm

442 nm

AMCA conjugate

347 nm

444 nm

Coumarin

360 nm

447 nm

7-Hydroxy-4-methylcoumarin

360 nm

447 nm

7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0

361 nm

448 nm

6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0

358 nm

450 nm

Hoechst 33342

352 nm

455 nm

Pacific Blue

404 nm

455 nm

Hoechst 33258

352 nm

455 nm

Hoechst 33258-DNA

352 nm

455 nm

Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0

404 nm

455 nm

PO-PRO-1

434 nm

457 nm

PO-PRO-1-DNA

435 nm

457 nm

POPO-1

433 nm

457 nm

POPO-1-DNA

433 nm

458 nm

DAPI-DNA

359 nm

461 nm

DAPI

358 nm

463 nm

Marina Blue

362 nm

464 nm

SYTOX Blue-DNA

445 nm

470 nm

CFP (Cyan Fluorescent Protein)

434 nm

474 nm

eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein)

437 nm

476 nm

1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS)

375 nm

479 nm

Indo-1, Ca free

346 nm

479 nm

1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)

375 nm

480 nm

BO-PRO-1-DNA

462 nm

482 nm

BOPRO-1

462 nm

482 nm

BOBO-1-DNA

461 nm

484 nm

SYTO 45-DNA

451 nm

486 nm

evoglow-Pp1

448 nm

495 nm

evoglow-Bs1

448 nm

496 nm

evoglow-Bs2

448 nm

496 nm

Auramine O

431 nm

501 nm

DiO

487 nm

501 nm

LysoSensor Green pH 5.0

447 nm

502 nm

Cy 2

489 nm

503 nm

LysoSensor Green

447 nm

504 nm

Fura-2, high Ca

336 nm

504 nm

Fura-2 Ca2+sup>

336 nm

505 nm

SYTO 13-DNA

488 nm

506 nm

YO-PRO-1-DNA

491 nm

507 nm

YOYO-1-DNA

491 nm

509 nm

eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)

488 nm

509 nm

LysoTracker Green

503 nm

509 nm

GFP (S65T)

489 nm

509 nm

BODIPY FL, MeOH

502 nm

511 nm

Sapphire

396 nm

511 nm

BODIPY FL conjugate

503 nm

512 nm

MitoTracker Green

490 nm

512 nm

MitoTracker Green FM, MeOH

490 nm

512 nm

Fluorescein 0.1 M NaOH

493 nm

513 nm

Calcein pH 9.0

494 nm

514 nm

Fluorescein pH 9.0

490 nm

514 nm

Calcein

493 nm

514 nm

Fura-2, no Ca

367 nm

515 nm

Fluo-4

494 nm

516 nm

FDA

495 nm

517 nm

DTAF

495 nm

517 nm

Fluorescein

495 nm

517 nm

Fluorescein antibody conjugate pH 8.0

493 nm

517 nm

CFDA

495 nm

517 nm

FITC

495 nm

517 nm

Alexa Fluor 488 hydrazide-water

493 nm

518 nm

DyLight 488

493 nm

518 nm

5-FAM pH 9.0

492 nm

518 nm

FITC antibody conjugate pH 8.0

495 nm

519 nm

Alexa 488

493 nm

520 nm

Rhodamine 110

497 nm

520 nm

Rhodamine 110 pH 7.0

497 nm

520 nm

Acridine Orange

431 nm

520 nm

Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0

499 nm

520 nm

BCECF pH 5.5

485 nm

521 nm

PicoGreendsDNA quantitation reagent

502 nm

522 nm

SYBR Green I

498 nm

522 nm

Rhodaminen Green pH 7.0

497 nm

523 nm

CyQUANT GR-DNA

502 nm

523 nm

NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA

497 nm

524 nm

DansylCadaverine

335 nm

524 nm

Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0

499 nm

524 nm

Fluoro-Emerald

495 nm

524 nm

Nissl

497 nm

524 nm

Fluorescein dextran pH 8.0

501 nm

524 nm

Rhodamine Green

497 nm

524 nm

5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0

504 nm

525 nm

DansylCadaverine, MeOH

335 nm

526 nm

eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)

514 nm

526 nm

Oregon Green 488

498 nm

526 nm

Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0

498 nm

526 nm

Fluo-3

506 nm

527 nm

BCECF pH 9.0

501 nm

527 nm

SBFI-Na+

336 nm

527 nm

Fluo-3 Ca2+

506 nm

527 nm

Rhodamine 123, MeOH

507 nm

529 nm

FlAsH

509 nm

529 nm

Calcium Green-1 Ca2+

506 nm

529 nm

Magnesium Green

507 nm

530 nm

DM-NERF pH 4.0

493 nm

530 nm

Calcium Green

506 nm

530 nm

Citrine

515 nm

530 nm

LysoSensor Yellow pH 9.0

335 nm

530 nm

TO-PRO-1-DNA

515 nm

531 nm

Magnesium Green Mg2+

507 nm

531 nm

Sodium Green Na+

507 nm

531 nm

TOTO-1-DNA

514 nm

531 nm

Oregon Green 514

512 nm

532 nm

Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0

513 nm

533 nm

NBD-X

466 nm

534 nm

DM-NERF pH 7.0

509 nm

537 nm

NBD-X, MeOH

467 nm

538 nm

CI-NERF pH 6.0

513 nm

538 nm

Alexa 430

431 nm

540 nm

Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2

431 nm

540 nm

CI-NERF pH 2.5

504 nm

541 nm

Lucifer Yellow, CH

428 nm

542 nm

LysoSensor Yellow pH 3.0

389 nm

542 nm

6-TET, SE pH 9.0

521 nm

542 nm

Eosin antibody conjugate pH 8.0

525 nm

546 nm

Eosin

524 nm

546 nm

6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0

526 nm

547 nm

6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride

525 nm

547 nm

Bodipy R6G SE

528 nm

547 nm

BODIPY R6G, MeOH

528 nm

547 nm

6 JOE

520 nm

548 nm

Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0

399 nm

549 nm

Cascade Yellow

399 nm

549 nm

mBanana

540 nm

553 nm

Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2

528 nm

553 nm

Alexa 532

528 nm

553 nm

Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0

533 nm

554 nm

6-HEX, SE pH 9.0

534 nm

559 nm

mOrange

548 nm

562 nm

mHoneydew

478 nm

562 nm

Cy 3

549 nm

562 nm

Rhodamine B

543 nm

565 nm

DiI

551 nm

565 nm

5-TAMRA-MeOH

543 nm

567 nm

Alexa 555

553 nm

568 nm

Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2

553 nm

568 nm

DyLight 549

555 nm

569 nm

BODIPY TMR-X, SE

544 nm

570 nm

BODIPY TMR-X, MeOH

544 nm

570 nm

PO-PRO-3-DNA

539 nm

571 nm

PO-PRO-3

539 nm

571 nm

Rhodamine

551 nm

573 nm

Bodipy TMR-X conjugate

544 nm

573 nm

POPO-3

533 nm

573 nm

Alexa 546

562 nm

573 nm

BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2

544 nm

573 nm

Calcium Orange Ca2+

549 nm

573 nm

TRITC

550 nm

573 nm

Calcium Orange

549 nm

574 nm

Rhodaminephalloidin pH 7.0

558 nm

575 nm

MitoTracker Orange

551 nm

575 nm

MitoTracker Orange, MeOH

551 nm

575 nm

Phycoerythrin

565 nm

575 nm

Magnesium Orange

550 nm

575 nm

R-Phycoerythrin pH 7.5

565 nm

576 nm

5-TAMRA pH 7.0

553 nm

576 nm

5-TAMRA

549 nm

577 nm

Rhod-2

552 nm

577 nm

FM 1-43

472 nm

578 nm

Rhod-2 Ca2+

553 nm

578 nm

Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0

552 nm

578 nm

FM 1-43 lipid

473 nm

579 nm

LOLO-1-DNA

568 nm

580 nm

dTomato

554 nm

581 nm

DsRed

563 nm

581 nm

Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide

372 nm

582 nm

Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0

555 nm

582 nm

Fluor-Ruby

554 nm

582 nm

Resorufin

571 nm

584 nm

Resorufin pH 9.0

571 nm

584 nm

mTangerine

568 nm

585 nm

LysoTracker Red

578 nm

589 nm

Lissaminerhodamine

572 nm

590 nm

Cy 3.5

578 nm

591 nm

Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0

573 nm

591 nm

Sulforhodamine 101, EtOH

578 nm

593 nm

JC-1 pH 8.2

593 nm

595 nm

JC-1

592 nm

595 nm

mStrawberry

575 nm

596 nm

MitoTracker Red

578 nm

599 nm

MitoTracker Red, MeOH

578 nm

599 nm

X-Rhod-1 Ca2+

580 nm

602 nm

Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2

579 nm

603 nm

Alexa 568

576 nm

603 nm

5-ROX pH 7.0

578 nm

604 nm

5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt)

578 nm

604 nm

BO-PRO-3-DNA

574 nm

604 nm

BOPRO-3

574 nm

604 nm

BOBO-3-DNA

570 nm

605 nm

Ethidium Bromide

524 nm

605 nm

ReAsH

597 nm

608 nm

Calcium Crimson

589 nm

608 nm

Calcium Crimson Ca2+

590 nm

608 nm

mRFP

585 nm

608 nm

mCherry

587 nm

610 nm

Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2

596 nm

613 nm

HcRed

590 nm

614 nm

DyLight 594

592 nm

616 nm

Ethidium homodimer-1-DNA

528 nm

617 nm

Ethidiumhomodimer

528 nm

617 nm

Propidium Iodide

538 nm

617 nm

SYPRO Ruby

467 nm

618 nm

Propidium Iodide-DNA

538 nm

619 nm

Alexa 594

590 nm

619 nm

BODIPY TR-X, SE

588 nm

621 nm

BODIPY TR-X, MeOH

588 nm

621 nm

BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0

590 nm

621 nm

Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2

567 nm

627 nm

YO-PRO-3-DNA

613 nm

629 nm

Di-8 ANEPPS

469 nm

630 nm

Di-8-ANEPPS-lipid

469 nm

631 nm

YOYO-3-DNA

612 nm

631 nm

Nile Red-lipid

553 nm

636 nm

Nile Red

559 nm

637 nm

DyLight 633

624 nm

646 nm

mPlum

587 nm

649 nm

TO-PRO-3-DNA

642 nm

657 nm

DDAO pH 9.0

648 nm

657 nm

Fura Red, high Ca

434 nm

659 nm

Allophycocyanin pH 7.5

651 nm

660 nm

APC (allophycocyanin)

650 nm

660 nm

Nile Blue, EtOH

631 nm

660 nm

TOTO-3-DNA

642 nm

661 nm

Cy 5

646 nm

664 nm

BODIPY 650/665-X, MeOH

646 nm

664 nm

Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2

569 nm

666 nm

DyLight 649

652 nm

668 nm

Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2

653 nm

668 nm

Alexa 647

653 nm

669 nm

Fura Red Ca2+

435 nm

670 nm

Atto 647

644 nm

670 nm

Fura Red, low Ca

472 nm

673 nm

Carboxynaphthofluorescein pH 10.0

600 nm

674 nm

Alexa 660

664 nm

691 nm

Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2

663 nm

691 nm

Cy 5.5

673 nm

692 nm

Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2

679 nm

702 nm

Alexa 680

679 nm

703 nm

DyLight 680

678 nm

706 nm

Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2

696 nm

719 nm

Alexa 700

696 nm

720 nm

FM 4-64, 2% CHAPS

506 nm

751 nm

FM 4-64

508 nm

751 nm


美照如下:

哎呀发错了,是如下:血流冲刷下的血管内皮细胞,Delta Vision所拍


作者简介:

Dr.Bing,艾比玛特公司有名的"内戳哥",英国利兹大学生物医学系博士后,主要研究方向为钙离子通道和钙信号在人体生理及疾病条件下的作用与调控机理研究,以及发现有潜力的药物靶点。之所以被称为"内戳哥",是因为他在2014年以共同第一作者的身份在Nature发表论文,揭示了血管内皮细胞感受血液剪应力的全新机制,被媒体广泛报道。近四年,“内戳哥”在Nature、Circulation Research等杂志参与发表SCI收录文章6篇,总影响因子近80,总引用过百。另有一篇一作文章投往Science子刊正在修回,还有两篇一作文章正在准备中。


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