激活形式构象的Integrin β7是多发性骨髓瘤CAR-T免疫治疗的新靶点
发布时间:2018-03-22         浏览人次:         发布人:Dr. 李敏寅

中文名:激活形式构象的Integrin β7是多发性骨髓瘤CAR-T免疫治疗的新靶点

英文名:The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma–specific target for CAR T cell therapy

发表单位:Osaka University

杂志Nature Medicine, 2017

影响因子30.357

解读人:李敏寅博士


摘要

基于单抗的免疫治疗的关键是寻找肿瘤细胞的靶点。本研究首先通过构建针对多发性骨髓瘤细胞的超过10,000个的单克隆抗体文库,并利用精巧的多部筛选方法,最后利用细胞流式分选法,从51个多发性骨髓瘤病人中找到了1个特异性靶点MMG49——激活形式的整联素β7 (integrin β7)。并且,通过各种细胞类型的流式分选,作者发现这个靶点在多发性骨髓瘤细胞中的特异性。而在肿瘤治疗方面,作者利用编码MMG49抗体胞外段改造的CAR-T细胞进行免疫治疗,CAR-T细胞能特异性识别多发性骨髓瘤细胞中的integrin β7,从而特异性杀死多发性骨髓瘤细胞,达到精确免疫治疗的目的。


研究背景

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是恶性浆细胞病,隶属于B细胞淋巴瘤的一种。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有免疫球蛋白或轻链过度生成,多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。多发性骨髓瘤虽然目前有一定的治疗方法,但容易复发。基于单抗的免疫治疗是未来多发性骨髓瘤治疗的潜在方法之一。本文利用了抗体组技术和基于细胞流式分选的方法,筛选出了新的多发性骨髓瘤的靶点,具有重要的临床治疗价值。


研究结果

1. 针对MM的单克隆抗体库的构建及筛选

作者首先使用经典的细胞杂交瘤技术构建了库容大于10,000个多种MM肿瘤细胞系的单克隆抗体文库。如何利用这个抗体文库进行biomarker的筛选?作者提供了一种新的思路:用健康人(对照组)的外周血单核细胞(PBMC)对抗体库进行反向初筛,从中筛选出大约500个不能和对照组PBMC结合的抗体(图1-a);再次,他们利用细胞流式技术,将对照组和病人组的骨髓细胞对这500个抗体再进行一次筛选,最终找到了一个单克隆抗体,MMG49(图1-a,b)。这个抗体能识别51个病人中的45个样品,也就是仅识别MM细胞(CD38+, CD45-),而不识别白细胞(CD38-, CD45+)(图1-b,c)。

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图1


2. MMG49单抗特异性识别激活形式构象的integrin β7

显然,接下来的工作便是鉴定出MMG49对应的抗原,找到特异性靶点。通过将MMG49阳性的MM细胞提取mRNA,构建cDNA文库,并利用病毒转染的方法转染到MMG49阴性的Ba/F3细胞系,通过MMG49流式分选富集这些MMG49阳性的细胞,PCR检测出插入片段对应的是integrin β7亚基的基因。再通过IP和ELISA,作者进一步验证了MMG49识别的抗原。作者还使用了细胞流式和integrin β7 KO的MM细胞系,进一步确认了MMG49识别的抗原是integrin β7。

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图2


3. MMG49具有很强的细胞特异性

值得注意的是,前人的研究表明integrin β7也在PBMC中的多种细胞中表达,这与本研究的结果显是相互矛盾的。这一矛盾如何解释?作者发现,MMG49并不单单识别一般构象的integrin β7,而是识别它的激活形式。通过比较识别一般构象的抗体FIB27和激活构象的抗体MMG49,可以发现,虽然FIB27识别B细胞、T细胞等其他免疫细胞,但MMG49几乎只特异性识别MM细胞。当在细胞系中加入Mn2+离子来激活integrin α4/β7,MMG49抗体的结合能力显著性增强。因此,作者找到了一种激活构象的integrin β7,是MM细胞的特异性膜蛋白标志物。

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图3


4. 体外和体内实验表明MMG49 CAR-T细胞具有特异性杀伤MM肿瘤细胞的作用

通过把MMG49的可变区cDNA序列装在CD28和CD3-ζ的N端,将亚克隆有这一片段的慢病毒转染进T细胞中,作者构建出MMG49胞外段的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell, CAR-T)。作者验证了CAR-T细胞可以分泌IFN-γ和IL-2细胞因子,并能在体外特异性杀死MMG49抗原阳性的细胞。

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图4


而在体内实验中,作者利用带有GFP荧光的MM.1S细胞系造模和生物体发光检测手段,发现MMG49 CAR-T细胞疗法能有效浸润骨髓组织,显著性降低减小骨髓瘤的体积,并实质性改善了肿瘤小鼠的存活率。

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图5


亮点及启示

1. 利用抗体组和细胞流式分选技术筛选出骨髓瘤特异性的靶点

建立抗体组之后,可以有多种方法筛选特异细胞的靶点,比如芯片等定量方法。而本研究使用了细胞流式分选法,通过多部筛选的策略,找到了能特异性识别MM细胞的抗体。通过IP、流式和KO细胞,作者验证了这一靶点对应的抗原是integrin β7。因此,流式分选法和多步的筛选策略是寻找细胞膜蛋白标志物的有效手段。此外,在验证抗体识别的对应蛋白中,作者使用一系列严谨的验证手段,也是一个很值得借鉴的地方。

2. 激活形式的integrin β7是一种特异的骨髓瘤细胞标志物

根据前人的研究结果,作者发现MMG49识别的integrin β7在各种细胞中的表达并没有本研究中体现的特异性。为了解决这个疑问,作者定位了MMG49在integrin β7中的识别位点,恰好是在integrin β7胞外段负责构象变化的一段序列。因此,本研究为寻找肿瘤功能性靶点和免疫治疗提供了全新的思路。

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