Beads抗体-Anti-GFP Tag mAb Agarose conjugated (避重轻链特制款)

Datasheet

产品描述

绿色荧光蛋白广泛应用于蛋白定位和蛋白动力学分析。GFP-beads是GFP-tag antibody 与琼脂糖凝胶微球(Agarose)偶联,专门用于纯化和检测细胞裂解液或菌体裂解液中的GFP标签蛋白。适用于IP实验。当细胞或菌体裂解液与本试剂混合,样本中的GFP标签重组蛋白与GFP beads特异性结合,其他杂蛋白不结合。本试剂结构稳定,结合GFP标签蛋白效率高。IP产物可以应用于质谱分析、 酶活性测定等生化分析手段中。

 

本产品是特别制备的GFP beads产品,使用该产品进行IP实验,在后续的IP-WB步骤中,可以完全避免抗体轻重链的条带出现。

 


产品储存

储存于4°C,禁止冻存。保质期12个月。


使用指南

1. 收集细胞:

对于一个免疫共沉淀反应 ,推荐使用 106-107 个表达GFP 融合蛋白的哺乳动物细胞。服出培养液, 加lml预冷PBS于细胞中并刮下细胞,之后将细胞转入预冷管中。4℃,500g离心3分钟,弃上清液。用预冷PBS洗两遍细胞沉淀物,轻轻重悬细胞。

2. 裂解细胞:

(1) 用 200μl预冷的Lysis buffer 重悬细胞.

注:在Lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂(推荐使用cocktail类型的蛋白酶抑制剂,货号A10004:200X 蛋白酶抑制剂复合物)

(2) 将离心管放在冰上30分钟,每10分钟重悬一次细胞。

(3) 16000g,4℃离心10分钟,将上清转移到一个新的预冷离心管中,加300μ1 dilution Buffer,丢掉沉淀。

注:在这步细胞溶解物可放入-80℃长期保存。同样需要在在dilution buffer中加入蛋白酶抑制剂。

3. 平衡beads:涡旋anti-GFP Agarose,吸取25μ1 anti-GFP Agarose至预冷500μ1 dilution buffer中, 1200g, 4℃离心2分钟,去掉上清,重复两次。

4. 结合蛋自:

(1) 将第3步获得的细胞蛋白提取液加入平衡后的anti-GFP Agarose中(如有需要,可取50μ1上清液作为input对照用于兔疫印迹分析),在4℃环境中上下颠倒孵育1小时。

(2) 1200g , 4℃离心2分钟,去掉上清。

5. 洗anti-GFP Agarose:重悬GFP beads于500μl预冷的溶解液中,1200g, 4℃离心2分钟,去掉上清,重复2-3次。

可选做:在第二次清洗中将盐浓度提高到500mM。

6. 洗脱结合蛋白:

(1) 100μl SDS loading buffer重悬anti-GFP Agarose。

(2) 将anti-GFP Agarose在95℃中加热10分钟,使免疫复合物分离出来。1200g, 4℃离心2分钟, 取上清跑SDS-PAGE。

(3) 如果后续IP产物需要进行质谱鉴定,可以使用以下方法来替代步骤(1)和(2):加50 μl 0.2M,PH2.5的甘氨酸-盐酸重悬anti-GFP Agarose,保持混匀状态孵育30s, 1200g, 4℃离心2分钟。将上清转移至新的离心管中,加入5μl lM PH10.4的Tris base中和,可重复此步骤来增加洗脱效率。

 

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