Ni NTA Beads 6FF是以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，配体与NiNTABeads相同（产晶结构见图1所示），具体性能见表1o Ni NTA Beads 6FF除了可以耐受苛刻的试剂条件（见表2）外， 因真耐压的基质， 可以耐受最高0.3 MPa的压力，更稳定， 因此该产品更适合用于工业大规模蛋白的纯化，可以在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

置于2-8℃保存。

1缓冲液的准备

可使用下列推荐缓冲液，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低眯口坐上样，高眯口坐洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。 缓冲液在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过；窟。 因为Ni NTA Beads 6FF重力柱可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化，两种方法所需缓冲液不同。 具体配置方法见表3、 表4和表5。

2.1细菌或酵母寝远的蛋白

1) 跳取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2) 表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7,000 rpm (7,500咱），离心15min收集菌休，然后按照菌体：LysisBuffer-1: 10 (WN) 加入 Lysis Bu他们加入终浓度为 1 mM 的 P MSF。 加入溶菌酶（工作浓度为 0.2-0.4 mg／时，如果 表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE,可以 不加溶菌酶），（同时也可加入真他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂 的结合）。

3）将菌体沉淀 悬浮起来 ，（如果菌液浓度高，也可考虑、加入 10 μg/ml RNaseA 和 5 阳／ml DNase I ），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4）将澄清的破碎液转移至离心管中， 10,000 「pm (15,000xg), 4"C离心20-30 min。取上清，置于冰上备用或－20℃保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1） 将细胞培养液转移至离心杯 ， 5,000 rpm (3,800xg ），离心10 min ，收集菌体得上清，如

上清申不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接加入柱子使用；如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用 Lysis Buffe「透析 才能加入柱子。

2） 对于大量体积的上清，需加入硫酸锻沉淀浓缩后，蛋白还需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.3 包涵体蛋白纯化｛变性条件）

1） 将培养液转移到离心杯中， 7,000 rpm (7,500xg ），离心15 min收集菌体，去掉上清。

2） 按照菌体：Lysis bu阳「（不合 8M 尿素） =1:10 (WN ）将菌体悬浮起来混匀， 冰浴超声破碎。

3） 将破碎液转移至离心宙中， 10,000rpm (15,000xg), 4℃离心20-30 min。去掉上清 ，步骤 2 和 3 可以重复一次。

4） 按照菌体： Lysis buffe（含 8M 尿素） =1:10 (W/V）将包涵体悬浮起来。

5） 变性条件下进行His 标签蛋白纯化 ，具体缓冲液配方见表 4 、表 5。

3 样品纯化

NI-NTA-Beads-6FF重力柱使用请参考以下说明，各溶液用量均按照柱体积计算（例如： 2 个柱体积， 1 ml 规格对应为 2ml溶液 ， 5ml 规格对应为 10 ml 溶液 ）。整个纯化流程大约需要 30min（主要取决于样品体积和溶液的粘稠性），操作快捷。使用流程请参考图1。

1）将 Ni-NTA-Beads-6FF重力柱固定在铁架台上，依次去掉下端塞和上端塞，流干重力柱的保护液。

2）向柱中加入 5 个柱体积的Lysis Buffer，进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

3）将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2min ，保证目的蛋白与介质充分接触 ，提高目的蛋自的回收率。收集流出液，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况，在出现问题时，

更方便寻找解决问题的方案，可以反复上样增加结合效率。

4）用 10-15 倍柱体积的 Wash Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。必要时可以调整咪唑的浓度进行洗杂。

5）使用 5-10 倍柱体积的日Elution Buffer进行目的蛋白的洗脱，分段收集 ，每个柱体积收集1管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。

6）依次使用3倍柱体积的 Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料。将重力柱保存在等体积的 20%乙醇中，置于2-8℃保存，防止填料被细菌污染。

4 SDS-PAGE 检测

将纯化得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE检测纯化效果。

在位清洗

当填料使用过程中发现流速明显减慢或者填料上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗操作。

建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除强疏水结合的蛋自，脂蛋白和脂类

通过使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积， 接触时间为 15-20min 可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液，清洗填料2倍柱体积。例如，含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液，接触时间为1-2小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱体积的去离子水清洗。

去除离子作用结合的蛋白

使用1.5 M NaCl溶液清洗10-15 min。然后再使用去离子水清洗10个柱体积。

填料再生

组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的镶离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当填料使用过程中发现颜色变浅，或者填料载量明显变低时，需要对填料进行镍离子剥离和重新挂镍离子，也就是填料再生。将填料装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。

1) 使用5倍柱体积去离子水清洗填料；

2) 使用5倍柱体积100 mM EDTA (pH 8.0）剥离镍离子；

3) 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

4) 使用0.5 M NaOH清洗5倍柱体积，停留10-15 min;

5) 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

6) 使用3-5倍柱体积100 mM NiSO4再生挂镍；

7) 使用10倍柱体积去离子水清洗；

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要将填料悬浮于等体积的20%乙醇中，置于2-8℃保存。