核酸研究试剂-First-Strand cDNA Synthesis Kit

Datasheet

产品描述

First-Strand cDNA Synthesis Kit是基于Reverse TranscriptaseTotal RNAPoly(A)+RNA合成 第一链cDNA的试剂盒。Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H- ) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程 改造后获得的全新逆转录酶,相较而言Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。 Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度,适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外,Reverse Transcriptase增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录,可合成长达12.3 kb的第一链cDNA First-Strand cDNA Synthesis Kit包含合成第一链cDNA所需的所有组分,并提供Random PrimersOligo (dT)23VN 两种cDNA合成引物。可根据实验需要选择Random PrimersOligo (dT)23VN或基因特异性引物作为逆转录引物, 合成的第一链cDNA产物可用于后续的PCR扩增、qPCR反应等实验。

产品组分及储存条件

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将所有组分存放在-20℃并避光保存。尽可能避免反复冻融


第一链cDNA合成步骤

1. RNA 变性:在 RNase-free PCR 管中配制如下混合液;65°C 加热 5 min,反应结束迅速置于冰上冷却 2 min 短暂离心。

Component

Volume

Oligo (dT)23VN (50 μM) or Random Primers (50 μM) or Gene Specific   Primers (2 μM)

1 μl

Total RNA (1 pg to 5 μg) or Poly(A)+ RNA (1 pg to 500 ng)

X μl

10 mM dNTP Mixture

1 μl

RNase-free Water

Up to 10 μl

*Note: RNA 变性步骤可选,RNA 变性有助于打开二级结构,提高逆转录效率;对长度超过 3 kb cDNA 片段,请勿省略该步骤。

2. 按下表配制逆转录反应体系:

Component

Volume

上述变性后反应液

10 μl

5X First-Strand Buffer

4 μl

RNase Inhibitor, Murine(40 U/μl)

1 μl

Reverse Transcriptase (200 U/μl)

1 μl

RNase-free Water

Up to 20 μl

3. 轻轻混匀上述反应物,瞬时离心,按下表设置逆转录程序:

企业微信截图_16939016023956.png


*Note:a. 如果使用的是 Random Primers,则需要设置此步骤;如果使用的是 Oligo (dT)23VN Gene Specific Primers 则可省略此步骤。 b. Reverse Transcriptase 对具有复杂二级结构的 RNA 模板仍仍具有良好的扩增能力,因此通常建议在 42°C 进行反应。当使用特异 性下游引物进行逆转录时,可能会因错配而扩增出非特异性产物,此时可在 45-50°C 进行反应以便减少非特异性扩增。

4. 得到的逆转录产物可立即用于后续PCRqPCR反应,也可分装后于-20°C短期保存,-80°C长期保存,避免反 复冻融。

*Note: 如果使用合成的第一链 cDNA 为模板进行 PCR 反应,模板加入量会对 PCR 的扩增效率有影响,其加入量为 PCR 反应液量的 1/10 下;在 RT-PCR 反应中,如果有非特异性扩增或无扩增产物时,可将第一链 cDNA 合成反应液用 RNase H 处理(如加入 1 μl RNase H 到合成反应液 37°C 孵育 20 min)。


引物选择

1. 如果模板来源于真核生物,建议选择 Oligo (dT)23VN,该引物可与真核生物 mRNA 3’ Poly(A)尾配对,获得最高 产量的全长 cDNA;如果模板来源于原核生物,建议选择 Random Primers Gene Specific Primers

2.当后续实验为 qPCR 时,可以将 Oligo (dT)23VN Random Primers 1:1 混合使用,可提高 qPCR 结果的真实性和重 复性。

3. Random Primers 特异性最低、适用性较广,mRNArRNAtRNA LncRNA 等模板均可用 Random Primers 进行 逆转录。一般 2 kb 以下的 cDNA 合成时 Random Primers 的使用量为 1-2 μl2 kb 以上的 cDNA 合成时 Random Primers 的使用量为 0.4-1 μl

4.当模板具有复杂二级结构或 GC 含量较高时,使用 Oligo (dT)23VN Gene Specific Primers 无法有效引导 cDNA 成时,可使用 Random Primers 为引物。 / 3 / www.apexbt.com 5. Gene Specific Primers 特异性最高。但有些情况下 Gene Specific Primers 无法有效引导第一链 cDNA 合成。可改用 Oligo (dT)23VN Random Primers 重新进行逆转录。


注意事项

1. 实验在冰上操作,过程中避免 RNase 污染。

2. RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量,RNA 提取过程应注意防止 RNA 降解。

J10002

货号 规格 价格(¥)
J10002 50μl

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Note:  Application as IHC, only suitable for histochemical staining or fluorescence staining of paraffin-embedded sections. Application as ICC/IF, suitable for histochemical or fluorescent staining of frozen sections, as well as chemical and fluorescent staining at the cellular level.

注意:抗体应用为IHC的,抗体只适合于石蜡切片的组化染色或者荧光染色。

抗体应用为IF/ICC的,抗体适合于冰冻切片的组化染色或者荧光染色,以及细胞水平的化学染色和荧光染色。

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