产品高保真 DNA 聚合酶能够为大部分 PCR 应用同时提供高保真性，强大 的扩增能力和更快

的扩增速度。高保真度使得 DNA 聚合酶成为克隆或其他后续 应用的较优选择。该款 DNA 聚

合酶是具有最高的准确性的 DNA 聚合酶中的一个，其错误率比 Taq DNA 聚合酶低 50 倍，比

Pyrococcus Furious DNA 聚合酶低 6 倍。该 DNA 聚合酶具有 5→3'聚合酶活性和 3'→5'外切酶

活性。它会在扩增产物两端产生平端，而没有 A 突出(A 突出通常出现在用 Taq 聚合酶扩增的

产物中)。在实验中该聚合酶能够扩增长达 10 kb 的片段。

本产品包含有 DNA 聚合酶(1 U /μL)和 5X HF 缓冲液（已添加 Mg2 +）， 50 mM 额外的 MgCl2

溶液，以及 DMSO(100%)。

在冰上进行实验操作

我们建议将所有反应组分放在冰上。实验者应在打开产品前仔细混合和离心所有管子，以确保均一性和改善回收率。因为储存缓冲液中含有高甘油含量，应该小心轻柔地移取该聚合酶。由于该酶具有 3'→5'核酸外切酶活性，在缺乏 dNTP 的情况下也许可降解引物，因此该DNA 聚合酶应最后添加到 PCR 混合物中。 由于该DNA聚合酶的性质，请注意使用该DNA聚合酶的实验操作指南，可能与其他聚合酶的指南不同。

a. 推荐的最终引物浓度为 0.4 μM，但可以在 0.2-1.0 μM 范围内变化，您可以调整浓度。一般推荐寡核苷酸引物长度在 20-40 bp 之间，理想的 GC 含量为 40-60％。

b. 对于富含 GC 的扩增子，建议添加 DMSO。对于 GC 含量非常低或扩增子> 20 kb 的扩增 子，不建议使用 DMSO。

c. 使用高质量纯化的 DNA 模板可以大大提高 PCR 反应的成功率。对于低复杂度 DNA（例如质粒、病毒、λ 或 BAC DNA），DNA 模板量可以在每 50 μL 反应体积 1pg-10ng 之间。对于高复杂度的基因组 DNA，每50 μL反应体积 DNA 模板量应为 50-250 ng。如果从cDNA合成反应中获得模板DNA，则模板的体积不应超过最终PCR反应体积的10％。

d. 聚合酶的最佳加入量取决于模板的量和PCR产物的长度。每50μL反应体积通常使用1U DNA 聚合酶将会产生良好的结果，但是根据扩增子的长度和难度，每50μL反应体系的最佳量可以在 0.5到1U之间。不建议超过2U/50μL（0.04U/μL），特别是对于长度超过5kb的扩增子。

e. DNA聚合酶应该使用高质量的dNTP进行扩增。聚合酶不能读取模板链中的dUTP-衍生物或 dITP，因此不建议使用这些类似物或含有它们的引物。

f. Mg^{2 +}已经被加入到缓冲液中，实验者不需要重复添加 Mg^{2 +}。如果存在螯合剂（例如 EDTA），或者您想要进一步提高酶的活性，则可能有必要另外添加Mg ²⁺。Kit中有额外的MgCl₂溶液提供。5×HF buffer中Mg²⁺的浓度为10 mM, 即在最终反应体系中Mg²⁺浓度为2 mM。

轻柔的混匀反应体系，并在离心机中离心。

实验者应迅速将反应体系转移至预热至变性温度（98℃）的 PCR 仪。

如果 PCR 仪没有热盖，请使用矿物油覆盖样品。

a. 对于大多数模板，我们建议在98°C下进行1分钟的预变性。一些模板可能需要更长的预变性时间，预变性时间的长度可以延长达3分钟。

b. DNA聚合酶的最佳退火温度可能与基于Taq的聚合酶明显不同。DNA 聚合酶具有稳定引物模板杂交的能力。对于大多数模板，我们建议使用55-58℃的退火温度10-30秒。如有必要，使用温度梯度来找出每个模板—引物对组合的最佳退火温度。

c. 延伸时间取决于扩增子的长度和复杂性。对于低复杂度的DNA（例如质粒、病毒、 λ 或 BAC DNA），每1kb使用15秒的延伸时间。对于高复杂度的基因组DNA，建议每1 kb 30 秒。对于一些cDNA模板，延伸时间可以增加到每 1kb 40 秒，以获得最佳结果。对于大部分模板，每 1 kb 20 秒可以使用。

d. 当引物 Tm 值至少为 69℃（> 20 nt）或 72℃（≤20 nt）时，推荐使用两步法。在 2 步法中，即使当引物 Tm> 72℃时，组合退火/延伸步骤也应在 72℃下进行。

如果需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，我们的产品SYBR Safe DNA Gel Stain（货号：J10003） 该产品安全低毒，推荐您选择使用。